Bach1克隆構建及其對肝癌細胞藥物敏感性的影響

時英英 楊 靖 時學秀 單 杰

(鄭州大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，河南 鄭州 450052)

轉錄因子BTB-CNC同源異構體(Bach)1屬于CNC轉錄因子家族，在體內廣泛存在，它是一種堿性亮氨酸拉鏈蛋白，其包含一個堿性亮氨酸拉鏈結構域和一個鋅指結構域，二者皆與Bach1的轉錄調控作用有關〔1〕。關于Bach1的研究主要集中在其對血紅素氧化酶1(HO-1)的作用上。HO-1具有抗氧化、抗凋亡等效應，實驗證實HO-1是一類保護細胞及抗氧化損傷的酶類，其表達可通過許多轉錄因子進行調控。Bach1在核內抑制HO-1的表達〔2〕。

1 材料與方法

1.1材料 大腸桿菌菌株E.Coli.DH5α、質粒pBI-EGFP、質粒pTet-Off、人肝癌細胞系SMMC-7721：本室保存；質粒pQE30-Bach1：美國教授饋贈；限制性核酸內切酶NheⅠ，MluⅠ，KpnⅠ，HindⅢ：Fermentas公司；PCR產物純化試劑盒：上海捷瑞生物工程股份有限公司；RPMI1640培養基：Gibco公司； 無支原體胎牛血清：北京索來寶公司；脂質體2000轉染試劑：Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒：華北制藥集團有限公司。

1.2重組質粒pBI-EGFP-Bach1的構建

1.2.1目的基因Bach1的獲取 采用CaCl2法制備感受態細菌，質粒pQE30-Bach1轉化進大腸桿菌DH5α，使用質粒提取試劑盒小量提取質粒,從提取的質粒 DNA中吸出少量,適當稀釋,使用紫外分光光度儀測定 OD260,計算質粒濃度，雙酶切鑒定質粒pQE30-Bach1，PCR擴增Bach1片段，PCR產物純化回收，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用凝膠成像系統分析酶切結果。

1.2.2構建重組質粒pBI-EGFP-Bach1雙酶切 處理質粒載體pBI-EGFP及目的基因Bach1，1%瓊脂糖凝膠電泳后,使用膠回收試劑盒按說明書分別回收pBI-EGFP和Bach1，純化后片段在 T4 DNA連接酶作用下進行連接，連接反應產物轉化感受態細菌，提取并鑒定重組質粒。

1.3重組質粒pBI-EGFP-Bach1在肝癌細胞SMMC-7721中的表達

1.3.1細胞培養 使用10%胎牛血清的RPMI1640培養基，于37℃，飽和濕度，5%CO2培養箱培養肝癌細SMMC-7721，隔天換液,保持細胞生長狀態良好，每次實驗使用細胞均處于對數生長期。

1.3.2轉染細胞 細胞計數后以1×105/孔接種在96孔板中，分為三組 ①陰性對照即未轉染組；②空質粒轉染組pBI-EGFP和Tet-off；③重組質粒組pBI-EGFP-Bach1和Tet-off的細胞。每組設3個平行孔。24 h貼壁后進行轉染。脂質體轉染參考說明書并按照需要改動。

1.3.3RT-PCR鑒定轉染重組質粒后轉錄因子Bach1、HO-1的RNA表達 RT2-PCR鑒定重組質粒mRNA表達提取細胞總RNA,使用InvitrogenM2MVLcDNA第一鏈合成試劑盒合成 cDNA第一鏈,取上述轉錄產物各 2 μg作為 PCR擴增的模板。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,用RGB顏色分析器4.0分析電泳結果，用掃描所得出Bach1、HO-1基因與β-actin基因的灰度值比值表示該基因的相對表達水平，并對Bach1、HO-1基因在空白組，空質粒轉染組和重組質粒轉染組中的表達進行分析。

1.4重組質粒pBI-EGFP-Bach1對肝癌細胞SMMC-7721藥物敏感性的影響 MTT〔3〕法檢測細胞對長春新堿(VCR)的藥敏性，設立對照組，未轉染組、轉染組。其中對照組細胞不做藥物或轉染處理，未轉染組只用長春新堿處理，轉染組先轉染重組質粒，轉染24 h后，加入不同濃度的VCR溶液：0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 μg /ml，MTT法檢測三組肝癌細胞對VCR的藥敏性。計算存活率〔存活率=(實驗孔OD值/對照孔OD值)×100%〕。計算50%細胞生長抑制所需的VCR藥物濃度即半數抑制率(IC50)。

1.5統計學分析 采用SPSS13.0軟件進行t及χ2檢驗。

2 結 果

2.1雙酶切鑒定質粒pQE30-Bach1 KpnⅠ/HindⅢ雙酶切質粒pQE30-bach1后，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到約3 400 bp和約2 200 bp的片段，大小與質粒pQE30及目的基因Bach1一致(見圖1)。說明質粒pQE30-Bach1中含有目的基因Bach1基因全序列。

2.2PCR擴增Bach1片段的純化回收 PCR擴增出含有酶切位點MluI/NheI的目的基因Bach1片段后回收，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到約2 200 bp片段，大小與目的基因Bach1一致。(見圖2)。

2.3重組質粒pBI-EGFP-Bach1的鑒定 MluⅠ/NheⅠ雙酶切處理連接后得到的質粒，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定可見約5 100 bp和約2 200 bp的片段，大小與質粒pBI-EGFP及目的基因Bach1一致(見圖3)。用目的基因Bach1的引物PCR鑒定重組質粒，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定可見約2 200 bp大小的片段(見圖3)。重組質粒pBI-EGFP-Bach1構建成功。

1：HindⅢ單酶切質粒pQE30-Bach1結果；2：KpnⅠ/HindⅢ雙酶切質粒pQE30-bach1結果

1，2，3皆為用PCR技術擴增目的基因Bach1所得條帶

1：MluⅠ/NheⅠ雙酶切重組質粒pBI-EGFP-Bach1所得條帶；2：使用重組質粒為模板PCR擴增目的基因Bach1所得條帶

2.4RT-PCR鑒定重組質粒在肝癌細胞SMMC-7721中的表達 重組質粒組的Bach1特異片段明顯比對照組，空質粒轉染組亮。β-actin灰度值的比值依次為：1.04±0.32，1.02±0.39，1.77±0.35差別具有統計學意義(P<0.05)，與1，2組相比3組HO-1明顯較暗，β-actin灰度值的比值依次為：0.95±0.22，1.02±0.31，0.74±0.21，差別具有統計學意義(P<0.05)，表明HO-1基因在轉染了重組質粒的SMMC-7721細胞中的表達明顯比未轉染組及空質粒轉染組細胞低。結果說明轉染重組質粒pBI-EGFP-Bach1后，肝癌細胞SMMC-7721中Bach1表達顯著增高，同時抑制了HO-1的表達，使其表達水平降低。見圖4。

1：空白對照組；2：空轉載體組；3重組質粒組

2.5不同組別藥物濃度對SMMC-7721細胞的抑制率 轉染組重組質粒pBI-EGFP-Bach1的細胞，在加入VCR后凋亡率比同等劑量未加入重組質粒的細胞明顯升高。轉染組和未轉染組之間差異明顯(P<0.05)。未轉染組的IC50為0.21 μg/ml，轉染組的IC50為0.15 μg/ml。二者相比，轉染組的半數抑制濃度低于未轉染組28.6%。見表1。

表1 不同組別藥物濃度對SMMC-7721細胞的抑制率(%)

3 討 論

本研究通過基因克隆技術構建了真核表達質粒pBI-EGFP-Bach1。再將重組質粒和其調控質粒Tet-off一同轉染進肝癌細胞SMMC-7721中，通過RT-PCR技術在RNA水平上可明顯看到重組質粒pBI-EGFP-Bach1能顯著抑制細胞中HO-1的表達，基于使用HO-1抑制劑在腫瘤內抑制HO-1活性〔3〕，以達到增強腫瘤細胞的對藥物的敏感性，使其在低濃度藥物作用下即能凋亡這一思路，本實驗將重組質粒pBI-EGFP-Bach1及其調控質粒Tet-off，通過脂質體轉染共轉染進肝癌細胞SMMC-7721中，使用長春新堿進行腫瘤細胞的體外藥敏試驗。有研究表明長春新堿對培養的人肝癌細胞株SMMC-7721有較顯著的抗癌作用〔4〕。本實驗結果表明相同劑量藥物作用下，轉染了重組質粒pBI-EGFP-Bach1的細胞，在加入VCR后凋亡率比同等劑量未加入重組質粒的細胞明顯升高。本實驗驗證了可通過抑制HO-1的表達來增加肝癌細胞對藥物的敏感性，減輕對正常細胞的傷害。

4 參考文獻

1郁衛東，梁 蓉，楊麗君，等.人類21號染色體轉錄調節相關基因作為早期分子診斷標記物的可行性研究〔J〕.中國生物工程雜志，2005；25(7)：66-70.

2Tomomi K,Kazuhiro T,Kazuhiro O,etal.Bach1 functions as a hypoxia-inducible repressor for the Heme Oxygenase-1 gene in human cells〔J〕. J Biol Chem，2003；278(11):9125-33.

3尤迎春，叢文銘，王 一，等.MTT比色分析法快速測定肝癌細胞株對化療藥物敏感性的方法研究〔J〕.癌癥，1996；15(3)：219-21.

4馬瑾瑜，余竹元，竺葉青，等.長春新堿對培養中的人肝癌細胞的作用〔J〕.上海醫科大學學報，1987；14(3)：2.