烏司他丁對細菌脂多糖共孵育的內皮祖細胞功能的影響

徐 敏 鮑 芳 喬魯軍

(東營市勝利油田中心醫(yī)院，山東 東營 257000)

隨著老齡化社會的到來，重癥醫(yī)學科(ICU)收治的膿毒癥患者亦趨于老齡化，老年患者常并發(fā)各種器官功能不全，更易發(fā)展為膿毒癥休克、多器官障礙綜合征(MODS)〔1～3〕。因此治療藥物的選擇上更加慎重，烏司他丁作為改善炎癥反應的藥物，近年來在使用安全上有較好的優(yōu)勢，但其療效及使用劑量上仍有不同的意見〔4～6〕。本實驗通過LPS干預EPCs后加入不同劑量的烏司他丁以檢測EPCs增殖、遷移功能，來模擬LPS誘導膿毒癥后，烏司他丁對EPCs的作用，以期在細胞水平觀察烏司他丁對膿毒癥的影響。

1 材料與方法

1.1EPCs來源 采集健康志愿者外周靜脈血，采用密度梯度離心法獲取單個核細胞，鋪板并培養(yǎng)，PBS除去非貼壁細胞并繼續(xù)培養(yǎng)至7 d。

1.2EPCs鑒定 將貼壁細胞與DiI-acLDL(2.4 μg/ml) (Biomedical公司，美國)在 37℃下共孵育1 h后檢測 DiI-acLDL的攝取量。2%多聚甲醛固定細胞10 min后PBS漂洗。37℃下與FITC-UEA-I (10 μg/ml) (Vector 公司，美國) 孵育1 h。最后采用激光共聚焦顯微鏡(Laser scanning confocal microscope， LSCM，Zeiss公司，德國)觀察，若細胞呈現Dil-acLDL和UEA-I雙染色陽性，說明EPCs鑒定成功。

1.3實驗分組 貼壁細胞隨機分成4組：①空白對照組：EGM-2MV標準液培養(yǎng)EPCs 48 h。②LPS組：采用EGM-2MV標準液配置的LPS液(100 ng/ml)培養(yǎng)EPCs 48 h。③烏司他丁-1、-2、-3組：采用EGM-2MV標準液配置的LPS液(100 ng/ml)培養(yǎng)EPCs 24 h后，再用前述LPS液配置的三種不同濃度烏司他丁液(100、200、400 IU/ml)培養(yǎng)EPCs 24 h。因細胞對培養(yǎng)液營養(yǎng)成分的需求，每24小時換液1次。

1.4增殖功能檢測 EPCs經過3 d的傳代培養(yǎng)，用PBS洗除非貼壁細胞，胰蛋白酶消化并離心(1 500 r/min)。除去上液，將細胞懸浮于EGM-2MV標準液，調節(jié)細胞濃度至1×105/ml。接種EPCs到96孔板，每孔加100 μl細胞懸浮液。24 h后去除上清液，加入EGM-2MV使細胞同步化，光學相差顯微鏡觀察每孔內細胞生長均勻。各孔加入10 μl MTT液，4 h后用酶標儀檢測490 nm處OD值。

1.5細胞遷移 EPCs經過3 d的傳代培養(yǎng)，用PBS洗除非貼壁細胞，再用0.25%胰蛋白酶消化細胞，離心(1 500 r/min)4 min，棄上液，懸浮于EGM-2MV標準液，調節(jié)細胞濃度至106/ml。向第1組Transwell下室加入600 μl EGM-2MV標準液、第2～5組加入配置好的LPS液，每組設6個復孔，并將100 μl EPCs 懸液接種到上室，上室與下室之間隔以 8.0 μm 孔徑硝酸纖維膜。37℃培養(yǎng)箱內孵育24 h，按實驗設計加入相應試劑，再孵育24 h，向下室加入60 μl MTT 液，采用酶標儀檢測490 nm處的OD值。

1.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件進行方差分析，組間比較根據方差齊性檢驗與否，采用S-N-K法或Tamhane方法。

2 結 果

2.1EPCs鑒定 光學相差顯微鏡下觀察EPCs細胞形態(tài)：細胞成簇排列，成短梭狀，增殖良好(見圖1)。用FITC-UEA-I和Dil-acLDL雙染色后采用LSCM觀察熒光表達：FITC-UEA-I和DiI-acLDL雙染色陽性細胞被認為是正在分化的EPCs，雙染陽性細胞的百分率均在94%左右。

圖1 光學相差顯微鏡觀察下的EPCs

2.2細胞增殖 EPCs與LPS共孵育之后細胞增殖能力顯著降低(P=0.000)。烏司他丁加入后EPCs的增殖OD值均有提高，且隨烏司他丁濃度增加，其增殖能力亦由顯著提高，組間比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表1。

2.3對遷移的影響 與空白對照組比較，EPCs遷移OD值在LPS作用后明顯降低(P=0.001)，與烏司他丁作用后，EPCs遷移能力較LPS組有改善，并見劑量-效應關系。見表1。

表1 LPS和不同濃度烏司他丁作用下EPCs的增殖、遷移OD值±s，n=10)

3 討 論

膿毒癥是由感染引起的系統(tǒng)性炎癥反應綜合征，發(fā)病機制復雜，涉及炎癥、免疫、凝血等一系列基本問題，可以導致膿毒癥休克和多器官障礙綜合征，是目前全球所有重癥醫(yī)學科病人死亡的主要原因〔7，8〕。各種感染一旦誘發(fā)全身反應綜合征(SIRS)，均稱為膿毒癥，隨著老齡化社會的到來以及醫(yī)保覆蓋人群的增加，ICU病房內，老年患者的床位占有率有逐年升高趨勢，老年患者往往存在臟器功能基礎差、多重耐藥菌定植、易合并院感等特點，膿毒癥極易向重癥膿毒癥、感染性休克轉化，“后抗生素時代”往往在這些患者身上得到更好地詮釋。EPCs是血管內皮細胞的前體細胞,在生理或病理因素刺激下,可從骨髓動員到外周血參與損傷血管的修復〔9〕。EPCs對膿毒癥血管損傷的修復發(fā)揮重要作用，研究表明，膿毒癥時，EPCs被動員、遷移、黏附在損傷血管處，不斷分化為內皮細胞(EC)，修復損傷血管，改善微循環(huán)〔10～12〕。

烏司他丁是健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的一種酸性糖蛋白，具有抑制廣譜蛋白酶的作用，分子量67 kD，由143個氨基酸殘基組成〔13〕。目前研究發(fā)現，機體在休克和炎癥的時候會產生大量的氧自由基以及炎性介質，造成組織細胞損害，烏司他丁能夠抑制氧自由基的產生、抑制多種炎性介質及心肌抑制因子，改善微循環(huán)，起到抗炎、抗休克作用，避免疾病惡化〔14～16〕。進一步從分子水平研究發(fā)現，烏司他丁可以上調IL-10 水平，抑制 NF-κB活性〔17〕，抑制炎癥反應，改善細胞損傷，烏司他丁對內皮細胞的保護已有相關文獻報道〔18〕，但對EPCs的作用鮮有研究。

4 參考文獻

1Dellinger RP，Levy MM，Rhodes A，etal.Surviving sepsis campaign：international guidelines for management of severe sepsis and septic shock，2012〔J〕.Intensive Care Med，2013；39:165-228.

2Grimm A，Teschner U，Porzelius C,etal.Muscle ultrasound for early assessment of critical illness neuromyopathy in severe sepsis〔J〕.Crit Care，2013；17:227.

3He XD，Wang Y，Wu Q,etal.Xuebijing protects rats from sepsis challenged with acinetobacter baumannii by promoting annexin A1 expression and inhibiting proinflammatory cytokines secretion〔J〕.Evid Based Complement Alternat Med，2013；2013：804940.

4Jiang GT，Chen X，Li D,etal.Ulinastatin attenuates renal interstitial inflammation and inhibits fibrosis progression in rats under unilateral ureteral obstruction〔J〕.Mol Med Rep，2014；10:1501-8.

5Chen X，Wang Y，Luo H,etal.Ulinastatin reduces urinary sepsis related inflammation by upregulating IL10 and downregulating TNF alpha levels〔J〕.Mol Med Rep，2013；8:29-34.

6Fang Y，Xu P，Gu C,etal.Ulinastatin improves pulmonary function in severe burn-induced acute lung injury by attenuating inflammatory response〔J〕.J Trauma，2011；71:1297-304.

7Toya SP，Li F，Bonini MG,etal.Interaction of a specific population of human embryonic stem cell-derived progenitor cells with CD11b+ cells ameliorates sepsis-induced lung inflammatory injury〔J〕.Am J Pathol，2011；178：313-24.

8Martini R，Kempfer CB，Rodrigues MA,etal.Bacterial contamination on platelet concentrates：identification，antimicrobial susceptibility profile and transfusion-related sepsis〔J〕.Rev Soc Bras Med Trop，2010；43：682-5.

9Pelliccia F，Pasceri V，Cianfrocca C,etal.Angiotensin Ⅱ receptor antagonism with telmisartan increases number of endothelial progenitor cells in normotensive patients with coronary artery disease：a randomized，double-blind，placebo-controlled study〔J〕.Atherosclerosis，2010；210：510-5.

10Spiel AO，Mayr FB，Leitner JM，etal.Simvastatin and rosuvastatin mobilize Endothelial Progenitor Cells but do not prevent their acute decrease during systemic inflammation〔J〕.Thromb Res，2008；123(1) ：108-13.

11Fan H，Goodwin AJ，Chang E,etal.Endothelial progenitor cells and a stromal cell-derived factor-1alpha analogue synergistically improve survival in sepsis〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2014；189：1509-19.

12Becchi C，Pillozzi S，Fabbri LP,etal.The increase of endothelial progenitor cells in the peripheral blood：a new parameter for detecting onset and severity of sepsis〔J〕.Int J Immunopathol Pharmacol，2008；21：697-705.

13Sato H，Kajikawa S，Kuroda S,etal.Impaired fertility in female mice lacking urinary trypsin inhibitor〔J〕.Biochem Biophys Res Comm，2001；281:1154-60.

14Meng XX，Wang RL，Gao S,etal.Effect of ulinastatin on paraquat-induced-oxidative stress in human type II alveolar epithelial cells〔J〕. World J Emerg Med，2013；4：133-7.

15Nakajima K，Goto Y.Differentiation of the anti-shock effect of ulinastatin from steroid hormone，by the continuous observation of microcirculation dynamics〔J〕.Circ Shock，1992；36：284-9.

16Onumata O，Takahashi T，Sato K，etal.Effects of ulinastatin on hypotension and hepatic circulation in brain dead rabbits〔J〕.Transplant Proc，2000；32：2290-2.

17Li W，Wu X，Yan F，etal.Effects of pulmonary artery perfusion with urinary trypsin inhibitor as a lung protective strategy under hypothermic low-flow cardiopulmonary bypass in aninfant piglet model〔J〕.Perfusion,2013；29(12)：2218-9.

18姜曉芬，池勝英，金烈烈，等.烏司他丁對體外循環(huán)中內皮細胞的保護作用〔J〕.中國體外循環(huán)雜志，2004；2(2) ：81-3.