LY-294002對人宮頸癌細胞株Bcl-2表達的影響

董瑩瑩 李 威

(遼寧省婦幼保健院婦產科，遼寧 沈陽 110005)

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，它介導的下游多種信號轉導通路的激活調節細胞的多種生理過程，包括細胞的增生、分化、凋亡。研究發現，PI3K/Akt參與了細胞的正常生理活性的調節，且只在細胞惡性轉化時表達是增加的，其過度表達對腫瘤的發生發展起著至關重要的作用〔1～3〕，但是，在宮頸癌的病理過程中，PI3K/Akt能否通過調節Bcl-2的表達參與腫瘤細胞的凋亡過程尚不清楚，需進一步研究。本研究采用Western 印跡和RT-PCR方法，檢測經不同濃度的PI3K抑制劑(LY-294002)處理的人宮頸癌細胞株的Bcl-2的表達變化，探討PI3K在宮頸癌的病理作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人宮頸癌Hela細胞購自中國科學院細胞所；RPMI-1640培養基購自Gibco BRL公司；PI3K抑制劑LY294002購自碧云天生物技術研究所，分子量307.3；鼠抗人單克隆Bcl-2購于美國Santa Cruz公司。

1.2細胞培養 人宮頸癌Hela細胞置于37 ℃，飽和濕度，5%CO2恒溫培養箱中常規消化傳代。以含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的培養液RPMI-1640培養，根據細胞生長狀態每2～3 d傳代1次。取生長狀態穩定，呈對數生長期細胞用于實驗。

1.3實驗分組 實驗使用細胞均為接種24 h后處于對數生長期細胞，分為對照組和LY294002干預組，干預組再細分為4個亞組，分別以終濃度為 5、10、20、40 μmol/L 的PI3K抑制劑LY294002處理人宮頸癌Hela細胞，作用48 h。

1.4Western印跡方法檢測各實驗組Bcl-2蛋白的表達 用蛋白裂解液RIPA(50 mmol/L Tris-base、1.0 mmol/L EDTA、150 mmol/NaCl、 0.1%SDS、1%TritonX-100、1% Sodium deoxycholate)及蛋白酶抑制劑(USA)提取細胞蛋白，用考馬斯亮藍G250結合法，測定蛋白濃度，計算加樣量。加入樣品緩沖液，沸水浴中加熱5 min使蛋白質變性，制備12%分離膠，4%濃縮膠，電泳，5%脫脂奶粉TTBS緩沖液4 ℃過夜。一抗鼠抗人單克隆Bcl-2、β-actin (1∶200) 室溫孵育2 h，洗膜，辣根酶標記羊抗鼠IgG-HRP (1∶5 000)室溫孵育2 h，洗膜后， ECL發光，暗室曝光顯影，凝膠成像分析系統上攝像分析，計算出各組樣品鼠抗人單克隆Bcl-2目標帶的光密度值與內參照β-actin 光密度值的比值。

1.5RT-PCR方法檢測各實驗組Bcl-2 mRNA的表達 按照Trizol(Gibco，USA)劑盒說明書的操作步驟進行總mRNA提取，然后以逆轉錄(RT法)先合成cDNA，再進行PCR擴增；Bcl-2的上、下游引物分別為：上游5′-TGAGTTCGGTGGGGTCAT-3′；下游為：5′-GGAGAAATCAAACAGAGGC-3′，擴增產物全長187 bp。β-actin的上游引物：5′-GAGACCTTCAACACCCAGCC-3′；下游引物為：5′- GCGGGGCATCGGAACCGCTCA-3′，擴增產物全長374 bp。擴增產物進行1.5%瓊脂糖電泳，UVP凝膠顯像儀掃描并進行圖像分析。以目的基因與β-actin光密度的比值代表目的基因的相對表達含量。

1.6統計學處理 采用SPSS13.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1Western 印跡檢測Bcl-2蛋白表達 對照組宮頸癌細胞株有大量的Bcl-2陽性表達(0.43)，在以終濃度為 5 μmol/L的LY294002處理48 h后，宮頸癌細胞株的Bcl-2陽性表達迅速降低(0.32)，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，而且隨著LY294002終濃度的升高，宮頸癌細胞株的Bcl-2陽性表達也隨之降低(0.25，0.23，0.2)。見圖1。

1～5：對照組、5、10、20、40 μmol/L LY294002干預組，下圖同

2.2RT-PCR檢測Bcl-2 mRNA表達 Bcl-2 mRNA在對照組宮頸癌細胞株即有大量的表達(0.8)，與對照組相比在經終濃度為5 μmol/L的LY294002處理后，實驗組宮頸癌細胞株的Bcl-2 mRNA的表達迅速降低(0.5，P<0.05)，而且隨著處理宮頸癌細胞株的抑制劑LY294002終濃度的升高，實驗組宮頸癌細胞株的Bcl-2 mRNA的表達也隨之降低(0.4，0.35，0.3)。見圖2。

圖2 RT-PCR檢測Bcl-2 mRNA表達

3 討 論

PI3K是由催化亞單位(p110)和調節亞單位(PIK3R1)組成的異源二聚體，PI3K負責下游作用底物磷酸磷脂酰肌醇肌醇環上的3＇羥基進行磷酸化，從而使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇轉變為3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇，這是許多細胞外生長因子刺激的關鍵活化步驟。磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶B(P13K/Akt)信號轉導通路廣泛存在于細胞中，對細胞的生存起著至關重要的調節作用〔4〕。P13K/Akt信號轉導通路通過以下幾種機制發揮抗凋亡調節作用：①下調R-RAS信號通路，抑制細胞凋亡〔5〕；②Akt磷酸化凋亡前體蛋白BAD，抑制其促凋亡作用，并促進Bcl-2發揮抗凋亡作用③ARt通過激活NF-kB信號通路，促進細胞存活〔6〕；④通過下調p53蛋白表達，阻斷P53介導的促凋亡轉錄反應；⑤誘導c-fos轉錄，發揮抗凋亡作用；⑥磷酸化forkhead蛋白，阻止其發揮調節凋亡相關基因轉錄功能〔7〕。研究發現，PI3K/AKT信號通路調節惡性腫瘤細胞的生長，侵襲轉移凋亡和血管形成等，與腫瘤的發生和發展密切相關〔8～10〕，研究發現，P13K蛋白的高表達和Akt蛋白的高表達與宮頸癌細胞的增殖、浸潤和轉移有一定的相關性，但是，在宮頸癌的病理過程中，PI3K/Akt參與腫瘤細胞的凋亡過程尚不十分清楚〔11〕。

Bcl-2家族在調節線粒體途徑中發揮了至關重要的作用，家族中的抗凋亡蛋白成員包括Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1等。促凋亡蛋白包括Bax、Bik、Bad和僅有BH3結構域的Bid、Bim、PUMA等BH3蛋白。這些蛋白多定位于細胞內的膜結構上，尤其是線粒體膜上。Bcl-2是線粒體凋亡通路中主要的調節蛋白， 其作用是抑制Caspase的激活底物， 如細胞色素C、凋亡誘導因子等從線粒體釋放到細胞質，抑制細胞凋亡，其在腫瘤細胞的凋亡過程中發揮著重要作用。研究發現，在宮頸癌Hela細胞凋亡過程中，Bcl-2基因表達下降，同時伴隨Bax、Bad等促凋亡基因表達的上調〔12～14〕，但是，在宮頸癌的病理過程中，PI3K/Akt能否通過調節Bcl-2的表達參與腫瘤細胞的凋亡過程尚需進一步研究。本研究結果提示上調Bcl-2的表達可能是PI3K/Akt信號通路調節宮頸癌的發生發展的重要環節之一。

4 參考文獻

1趙聞雨,徐澤寬,朱 毅,等.渥曼青霉素對胰腺癌細胞增殖和生存的影響〔J〕.中華實驗外科雜志,2006；23(12):1563-4.

2陳劍英,張 波,王國斌,等.抑癌基因PTEN在乳腺癌激素耐受細胞中的表達〔J〕.中華實驗外科雜志,2005；22(10):429-31.

3Zhang XY,Zhang HY．Elevated phosphatidylinositol 3-kinase activation and its clinicopathological signi ficance in cervlcal cancer〔J〕.Eur J Obstet Gynecol Reproduc Biol,2008；139(2)：237-44.

4張麗麗,吳素慧，高燕燕,等. 磷脂酰肌醇-3-激酶抑制劑對人宮頸癌細胞株生長的影響〔J〕.中國醫療前沿,2011;6(2):40-1.

5Park JK，Cho CH，Ramachandran S，etal.Augmentation of sodium butyrate-induced apoptosis by phosphatidylinositol 3-kinase inhibition in the human cervical cancer cell-line〔J〕．Cancer Res Treat,2006;38(2):112-7.

6黃秀蘭，崔國輝，周克元.P13K-Akt信號通路與腫瘤細胞凋亡關系的研究進展〔J〕.癌癥,2008; 27(3)：331-6.

7Reuben J，Shaw LC，Cantley M.Ras，PI3K/AKT and mTOR signalling controls tumour cell growth〔J〕.Nature,2006;441(3)：424-30.

8韓 靜,張慶瑜,康春生,等. LY294002 抑制PI3K/AKT 信號通路對胃腺癌SGC-7901 細胞的影響〔J〕.中國腫瘤臨床,2011;38(5):255-8.

9Samuels Y,Ericson K. Oncogenic PI3K and its role in cancer〔J〕.Curr Opin Oncol,2006;18(1): 77-82.

10Han Z,Wu K,Shen H,etal.Akt1/protein kinase B alpha is involved in gastric cancer progression and cell proliferation〔J〕.Dig Dis Sci,2008;53(7): 1801-10.

11姚婷婷,戴玉珍,李勝澤. 磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶B在宮頸癌組織中的表達及意義〔J〕.癌癥,2008;27(5):525-30.

12劉風仙,宋 揚.刺參酸性黏多糖對宮頸癌Hela 細胞凋亡及Bax,Bcl-2基因表達的影響〔J〕． 實用醫學雜志，2010;26(12):2089-91.

13Ho GK,Heesang S,Deok HY,etal.Cordyceps pruinosa extracts induce apoptosis of Hela cells by a caspase dependent pathway〔J〕.J Ethnopharmacol,2010;128(2): 342-51.

14周 希，呂潔玉，龔寶蘭.下調CDl47通過Bcl-2途徑誘導宮頸癌細胞SiHa細胞凋亡的研究〔J〕.南方醫科大學學報,2010;30(7):1695-8.