抑制CK2增加Sorbitol引起的肺癌細胞凋亡

齊 昕 徐曉光 蔣穎超

(吉化集團公司總醫院,吉林 吉林 132001)

許多研究顯示，山梨醇(Sorbitol)作為一種糖醇可以誘導多種癌癥細胞凋亡〔1，2〕。在肺癌細胞中Sorbitol可以誘導細胞死亡，然而，Sorbitol也可以增加酪蛋白激酶(CK)2的表達，因此被認為是Sorbitol應用的弊端。 CK2是一種致癌基因，在包括肺癌在內的多種人類腫瘤中普遍上調。研究發現CK2可以參與調控細胞生長、增殖和凋亡〔3〕，通過激活核轉錄因子(NF)-κB促進癌癥細胞存活〔4,5〕，保護癌癥細胞免受藥物誘導的凋亡〔6〕。研究顯示，通過siRNA技術或抑制劑抑制CK2的活性可以引起癌癥細胞凋亡〔7～11〕。因此靶向CK2可能會為癌癥治療或者聯合治療提供一種可能性。本文分析CK2抑制劑(TBB)與Sorbitol聯合應用在腫瘤抑制中的效應及其根本機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 山梨醇(Sorbitol)，TBB，四甲基偶氮唑藍(MTT)購自Sigma公司(美國)，胎牛血清和DMEM培養基購自Gibco公司(美國)。

1.2細胞株與細胞培養 人肺癌A549細胞購自美國ATCC公司，細胞于含10%胎牛血清DMEM培養基中，當A549細胞生長至對數生長期時進行細胞傳代和實驗。

1.3MTT法檢測細胞活性 A549細胞以1×104/ml密度接種于96孔細胞培養板中，每孔加100 μl，待細胞隔夜培養完全貼壁后給予不同的藥物，繼續培養24 h后，加入MTT溶液后繼續培養4 h，分為對照組(Control)，Sorbitol 1 h組，Sorbitol 2 h組，Sorbitol 3 h組。結束后用加樣器棄除上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩器上混勻10 min，用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度(A)值。按下面公式計算細胞存活率。細胞存活率 (%) =〔A實驗孔-A空白孔/(A對照孔-A空白孔)〕×100%

1.4Western印跡檢測細胞蛋白表達 將各組藥物處理過的A549細胞，加入細胞裂解液(RIPA)，用細胞刮將貼壁細胞刮下，收集到1.5 ml離心管中，裂解20 min后，離心收集上清，測蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸變性后進行丙烯酰胺凝膠電泳。分離膠濃度10%，電泳結束后將膠上的蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，100 V，轉膜2 h，轉膜結束后5%脫脂奶粉封閉1 h。封閉結束后，加入相應的一抗(Cell Signaling公司1∶1 000) 4℃孵育過夜，第二天加入對應的二抗 (Cell Signaling公司1∶5 000)室溫孵育2 h，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗3次膜，每次15 min，化學熒光法(ECL)顯影，掃描。

2 結 果

2.1Sorbitol抑制肺癌A549細胞生長 對照組細胞存活率為1。Sorbitol可以引起細胞活性降低，并呈時間依賴性。Sorbitol作用1，2，3 h后細胞存活率分別為(79±4.37)%、(64.4±3.74)%、(50.4±2.65)%。不同濃度Sorbitol(0.5、1、1.5 mol/L)可以顯著降低細胞活性，各組細胞存活率分別為(77.5±2.03)%、(62.7±1.74)%、(49.9±2.2)%，并呈劑量依賴性。

2.2Sorbitol介導A549細胞凋亡 分別用0.5、1、1.5 mol/L Sorbitol處理A549細胞，Western印跡檢測發現不同濃度的Sorbitol可以明顯引起細胞色素C釋放，誘導caspase3和RARP的活化。見圖1，表1。

圖1 Sorbitol對A549細胞Cytochrome C、Cleaved caspase-3和Cleaved PARP表達水平的影響

表1 Sorbitol對A549細胞Cytochrome C, Cleaved caspase-3和Cleaved PARP表達水平的影響±s)

2.3聯合應用TBB增加Sorbitol對A549細胞的生長抑制 結果顯示，單獨應用TBB對細胞活性沒有影響，聯合應用TBB增加了Sorbitol在A549細胞中的生長抑制效應。同時，聯合應用TBB可以顯著增加細胞色素C的釋放、caspas-3的活化以及RARP的剪切，結果顯示，聯合應用TBB可以增加Sorbitol誘導的細胞凋亡。見圖2，表2。

2.4TBB可能通過恢復Sorbitol誘導的早幼粒細胞性白血病(PML)降低促進了凋亡 在0.5、1、1.5 mol/L濃度下Sorbitol可以顯著降低細胞內PML蛋白表達水平(0.277±0.064、0.186±0.075、0.112±0.057，對照組為0.326±0.073)；而聯合應用TBB，細胞內PML蛋白表達水平回升，對照組為0.156±0.054，TBB組為0.163±0.042，Sorbitol組為0.075±0.033，Sorbitol+TBB組為0.149±0.042。見圖3，圖4。

圖2 TBB對Sorbitol引起A549細胞Cytochrome C、Cleaved caspase-3和Cleaved PARP水平改變的影響

表2 CK2抑制劑TBB對Sorbitol引起A549細胞活性的影響±s)

圖3 不同濃度Sorbitol對A549細胞PML蛋白表達水平的影響

圖4 TBB對Sorbitol引起A549細胞PML水平改變的影響

3 討 論

有報道稱，Sorbitol作為一種己糖可以引起Hep-2細胞凋亡，并且可以在胃癌細胞系中誘導細胞核和DNA斷裂〔1〕。同樣有研究表明，在人類白血病K562細胞中，Sorbitol可以上調bax、下調bcl-2，最終導致細胞色素C的釋放〔2〕。本文的結果顯示Sorbitol可以顯著抑制肺癌A549細胞的生長，增加細胞色素C的釋放以及caspase3的活化和RARP的剪切。然而數據也顯示，Sorbitol可以增加CK2的水平，從而發揮一定的促活功能。

CK2的促瘤效應與其可以下調PML蛋白的功能息息相關〔12〕。PML最初是在急性早幼粒細胞性白血病(APL)t(15；17)染色體異位的斷點處被確認的〔13,14〕。并且PML蛋白屬于一個龐大的蛋白家族，這一家族蛋白普遍存在一個非結構化的C末端區域以及位于N末端的RBCC結構域，包括一個環指結構(R)、兩個附屬鋅指結構(B盒；B)和一個α-螺旋卷曲(α-helical coiled-coil)結構域(CC)。RBCC結構域調控蛋白質-蛋白質相互作用和PLM蛋白的多聚化〔15〕。在細胞中，PML蛋白在調控細胞生長，轉化抑制和衰老中起到關鍵作用。而且小鼠內PML蛋白的失活導致了癌癥敏感性〔16,17〕。PML參與了復雜的腫瘤抑制信號網絡，包括激活p53和抑制PI3K/AKT〔15〕。已有研究證明，PML在許多癌癥中是下調的，包括肺癌、結腸癌、胃癌、乳腺癌和中樞神經系統腫瘤〔18〕。

然而，PML幾乎不發生突變，而其下調主要是由其他分子對它的翻譯后修飾引起的〔19〕。CK2是PML重要的調控者之一。CK2通過直接磷酸化PML第517位絲氨酸促進泛素介導的降解途徑從而調控PML蛋白水平，并且在體內試驗中，抑制CK2可以增加PML蛋白的腫瘤抑制功能〔12〕。在本研究中，應用蛋白激酶CK2選擇性細胞滲透性抑制劑4,5,6,7-四溴-1H-苯并三唑(TBB)〔20〕抑制在人類肺癌細胞系A549細胞中的CK2，結果發現聯合應用TBB可以明顯恢復PML蛋白水平。

聯合化療是抑制細胞內不同存活通路的有效的癌癥治療策略。在這項研究中，將TBB與Sorbitol聯合應用來誘導肺癌A549細胞凋亡。除外其凋亡效應，發現Sorbitol可以降低PML蛋白水平，而這可能是單一Sorbitol治療的缺陷。因此聯合應用CK2抑制劑TBB處理細胞。在肺癌A549細胞中可見，與單一應用Sorbitol相比，聯合應用TBB可以通過抑制CK2明顯恢復PML蛋白水平，并且抑制細胞生長。同時發現，聯合用藥可以增加Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的水平，這些結果提示Sorbitol聯合應用TBB可能是肺癌治療的一種可行性策略。

4 參考文獻

1Teramachi K,Izawa M.Rapid induction of apoptosis in human gastric cancer cell lines by sorbitol〔J〕.Apoptosis,2000;5(2):181-7.

2Marfè G,Morgante E,Di Stefano,etal.Sorbitol-induced apoptosis of human leukemia is mediated by caspase activation and cytochrome c release〔J〕.Arch Toxicol,2008;82(6):371-7.

3Ahmad KA,Wang G,Slaton J,etal.Targeting CK2 for cancer therapy〔J〕.Anticancer Drugs,2005;16(10):1037-43.

4Romieu-Mourez R,Landesman-Bollag E,Seldin DC,etal.Protein kinase CK2 promotes aberrant activation of nuclear factor-κB,transformed phenotype,and survival of breast cancer cells〔J〕.Cancer Res,2002;62(22):6770-8.

5Romieu-Mourez R,Landesman-Bollag E,Seldin DC,etal.Roles of IKK kinases and protein kinase CK2 in activation of nuclear factor-κB in breast cancer〔J〕.Cancer Res,2001;61(9):3810-8.

6Guo C,Yu S,Davis A,etal.A potential role of nuclear matrix-associated protein kinase CK2 in protection against drug-induced apoptosis in cancer cells〔J〕.J Biol Chem,2001;276(8):5992-9.

7Bortolato A,Cozza G,Moro S.Protein kinase CK2 inhibitors: emerging anticancer therapeutic agents〔J〕?Anticancer Agents Med Chem,2008;8(7):798-806.

8Trembley JH,Chen Z,Unger G,etal.Emergence of protein kinase CK2 as a key target in cancer therapy〔J〕.Biofactors,2010;36(2):187-95.

9Hanif IM,Shazib MA,Ahmad KA,etal.Casein kinase Ⅱ:an attractive target for anti-cancer drug design〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2010;42(10):1602-5.

10Faust RA,Tawfic S,Davis AT,etal.Antisense oligonucleotides against protein kinase CK2-alpha inhibit growth of squamous cell carcinoma of the head and neck in vitro〔J〕.Head Neck,2000;22(4):341-6.

11Trembley JH,Unger GM,Tobolt DK,etal.Systemic administration of antisense oligonucleotides simultaneously targeting CK2alpha and alpha' subunits reduces orthotopic xenograft prostate tumors in mice〔J〕.Mol Cell Biochem,2011;356(1-2):21-35.

12Scaglioni PP,Yung TM,Cai LF,etal.A CK2-dependent mechanism for degradation of the PML tumor suppressor〔J〕.Cell,2006;126(12):269-84.

13Louria-Hayon I,Grossman T,Sionov RV,etal.The promyelocytic leukemia protein protects p53 from Mdm2-mediated inhibition and degradation〔J〕.J Biol Chem,2003;278(35):33134-41.

14Bernardi R,Papa A,Pandolfi P.Regulation of apoptosis by PML and the PML-NBs〔J〕.Oncogene,2008;27(48):6299-312.

15Bernardi R,Pandolfi PP.Structure,dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol,2007;8(12):1006-16.

16Salomoni P,Pandolfi PP.The role of PML in tumor suppression〔J〕.Cell,2002;108(2):165.

17Trotman LC,Alimonti A,Scaglioni PP,etal.Identification of a tumour suppressor network opposing nuclear Akt function〔J〕.Nature,2006;441(7092):523-7.

18Gurrieri C,Capodieci P,Bernardi R,etal.Loss of the tumor suppressor PML in human cancers of multiple histologic origins〔J〕.J Nat Cancer Inst,2004;96(4):269-79.

19Macleod K.Tumor suppressor genes〔J〕.Curr Opin Genet Dev，2000;10(1):81-93.

20Sarno S,Reddy H,Meggio F.Selectivity of 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole,an ATP site-directed inhibitor of protein kinase CK2 ('casein kinase-2')〔J〕.FEBS Letters,2001;496(1):44-8.