紫杉醇和微小RNA對非小細胞肺癌的協同抑制作用

郭威早 紀 紅 嚴之紅 劉會臣

(航天中心醫院高干二科，北京 100049)

根據流行病學調研，肺癌是我國男性中發病率最高的惡性腫瘤，在女性中的發病率也高居第二位〔1〕。紫杉醇是由紅豆杉科植物中提取的化合物，1992年獲得美國食品藥品管理局(FDA)批準用于腫瘤治療〔2〕，在非小細胞肺癌治療中的應用也在逐步推廣〔3〕。然而，由于抗藥性的不斷出現，如何在紫杉醇的抗腫瘤治療中實現增敏增效業已成為迫切的臨床需求〔4〕。在已經試驗的臨床化療策略中，采用表皮生長因子(EGFR)抑制劑與紫杉醇配合的療法展示了良好的臨床運用前景〔5〕。微小RNA (miRNA)是基因調控的核心途徑之一，在細胞的生長、發育、分化以及對環境的適應中發揮著非常重要的作用〔6，7〕，通過選擇特定的miRNA實現對EGFR的特異性抑制，將抗EGFR的miRNA和紫杉醇聯合運用，可以發揮化藥給藥途徑簡便而生物藥特異性高等優勢。本研究觀察EGFR特異性調控miRNA與紫杉醇對肺癌細胞的協同抑制效應。

1 材料與方法

1.1肺癌細胞株體外培養 人非小細胞肺癌細胞株A549和HCC827來源于美國ATCC公司，A549的培養基為F-12K，HCC827的培養基為RPMI-1640，使用前均加入10%胎牛血清。培養基及胎牛血清購自Invitrogen公司。培養條件為Forma-3110型二氧化碳溫箱，5% CO2,37℃。初期培養采用200 ml培養瓶，結束后采用0.25% 胰蛋白酶合并0.53 mmol/L EDTA溶液處理10 min，細胞脫壁收集后以10 ml相應無血清培養基清洗3遍，轉入12孔板進行分盤培養，每孔加入細胞數約5×104, 加入含血清培養基1 ml。

1.2紫杉醇處理 紫杉醇(Sigma-Aldrich公司)以二甲基亞砜(DMSO)制成1 μmol/L儲存液，以相應無血清培養基進行梯度稀釋，處理細胞的終濃度分別為0.01、0.1、1、2.5、5、10、15、30、50、100 nmol/L，處理時間為72 h。每個濃度下，有3個培養孔同時處理，檢測結果取均值。

1.3調控表皮生長因子miRNA的選擇 以微小RNA“種子區”(seed)完全匹配為首輪篩選標準，從TargetScan和miRDB兩個微小RNA數據庫中篩選。次輪篩選標準：候選微小RNA必須被上述兩個數據庫預測為人EGFR的調節miRNA。依據上述標準，最終選擇了hsa-miR-545-3p(簡稱miR-545)。

1.4miR-545的細胞轉染 miR-545前體增強劑購自Ambion公司，用于對腫瘤細胞內EGFR表達的mRNA發揮特異性抑制作用。miRNA轉染采用Neuromics公司iFect轉染試劑盒，以miR-545紊亂序列作為陰性對照。轉染在腫瘤細胞分盤培養前進行。miRNA轉染劑量在前期預實驗的基礎上，正式實驗劑量選擇為20 nmol/L。細胞在轉染狀態下繼續培養48 h后進入后續實驗。

1.5MTT法細胞生長抑制實驗 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(噻唑藍，MTT)購自Sigma-Aldrich。藥物處理結束后，清洗培養孔，然后加入200 μl 無血清培養基，再加入10 mmol/L MTT至終濃度1.0 mmol/L。37℃孵育3小時后加入200 μl 10% HCl-SDS混勻，37℃孵育3 h后于570 nm波長進行吸光度分析。

2 結 果

2.1紫杉醇對肺癌細胞的抑制具有顯著劑效關系 紫杉醇對A549和HCC827非小細胞肺癌細胞的生長均表現出強烈的抑制作用。生長抑制作用隨劑量的增加而增強。在0.1～5.0 nmol/L的劑量區間內，抑制效應隨劑量的增加表現出接近于線性的同步增加。劑量超過15 nmol/L后，抑制效應漸趨飽和 (圖1)。

2.2miR-545對紫杉醇的抑癌作用具有增強效應 肺癌細胞在進行紫杉醇處理之前如果增加miR-545前體的細胞轉染，則總體抑癌作用較單純紫杉醇明顯增強(圖1)。 2株肺癌細胞相比較，以半抑制濃度(IC50)為指標對于A549細胞，miR-45未轉染組IC50值為6.30 nmol/L，轉染組IC50值為4.58 nmol/L，對于HCC827細胞，miR-45未轉染組IC50值為4.36 nmol/L，轉染組IC50值為2.55 nmol/L，miR-545對HCC827抑制作用的強化(IC50減少41.6%)高于對A549抑制作用的強化(IC50減少27.3%) (P<0.05)。

a.A549肺癌細胞株，b.HCC827肺癌細胞株；曲線為非線性回歸擬合，miRNA指miR-545前體

3 討 論

耐藥性在肺癌的臨床治療中已構成一個重要的挑戰，一些肺癌的治療在初期表現出臨床療效之后出現抗藥，從而導致癌組織重新進展〔8，9〕。作為臨床應對策略，抗腫瘤治療領域內開展了多種手段的探索，包括采用新技術建立新的給藥途徑，以及利用分子生物學技術對藥物進行增效等〔10〕。在抗肺癌藥耐藥的機制中，藥物代謝以及分子信號傳導的改變是其中重要因素〔11，12〕，而miRNA在代謝調節和分子信號傳導中均具有關鍵的調節作用，因此在化療耐藥性方面必然引起關注。事實上，基于臨床觀察和實驗研究，miRNA與肺癌耐藥性的密切聯系已形成一定的共識〔13〕，正在逐步向臨床應用拓展。

紫杉醇作為一種從植物提取的具有抗癌活性的天然化合物，是抗腫瘤藥物研究的熱點，其運用范圍也在逐步擴大，在非小細胞肺癌中主要是以聯合用藥的方式促進提高化療的療效。以紫杉醇在非小細胞肺癌的化療中與血管表皮生長因子(VEGFR)抑制劑聯合運用為例，雖然增加了藥效，但生存率并沒有明顯改善，一種可能的解釋是毒性的增加〔14〕。化療藥的聯合運用，雖然在很多情況下可以增加藥效，但毒性的增加成為一個較大的負面因素。miRNA屬于內源性成分，同時具有高度的特異性，因此其毒性可控性較好。抑制表皮生長因子(EGFR)是非小細胞肺癌臨床治療的重要手段〔8〕，所以本研究采用針對EGFR的miRNA與紫杉醇進行協同。在2株代表性的非小細胞肺癌中均表現出增加藥效作用，在細胞水平上驗證了化藥和生物制劑的協同抗癌作用。

在本次實驗觀察中，2株非小細胞肺癌細胞A549和HCC827在紫杉醇生長抑制和miR-545與紫杉醇的協同抑制中的表現不盡相同。以IC50觀察，HCC827在本研究中表現出對紫杉醇更高的敏感性，因此提示非小細胞肺癌在細胞水平上也存在藥效的差異。此外，miR-545在HCC827細胞中對紫杉醇的增效作用無論在幅度，還是在顯著性方面都高于A549細胞。HCC827細胞在EGFR酪氨酸激酶區域有一個獲得性突變(E746-A750缺失)， 這個突變有可能增加了該細胞對于EGFR抑制的敏感性〔15〕。

本研究以分子生物學手段，通過選擇性的miRNA調節，在非小細胞肺癌中觀察到miR-545對紫杉醇生長抑制作用的協同效應，實驗結果符合理論預期。這一結果對改善非小細胞肺癌的化療抗藥性問題提供了具有實用價值的分子藥理學依據，這種結合化療藥物和生物制劑的抗癌治療手段值得深入探討。

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