不同年齡、性別人群血管緊張素原基因T704C多態性與動脈硬化性腦梗死的相關性

李宏芬 沈志霞 王穎杰 顔秉政 劉子洪 安 潔

(河北聯合大學附屬開灤總醫院檢驗科，河北 唐山 063000)

血管緊張素原(AGT) 作為腎素-血管緊張素系統(RAS)唯一的初始反應底物，可能在高血壓和相關疾病如動脈硬化性腦梗死(ACI)的發生、發展中起著相當重要的作用。近年已有研究表明AGT基因T704C多態性與高血壓相關〔1〕。本研究從基因水平分析AGT基因T704C多態性及年齡、性別因素與ACI的關系。

1 對象與方法

1.1對象 2002年3～9月開灤(集團)有限責任公司2 206名離退休職工進行體格檢查和問卷調查，經排除臨床指標、基因檢測不完整者，所得資料完整者計1 990名，其中男性1 289名，女性701名，年齡45～93(平均65.29)歲，均為漢族〔此研究樣本資料庫由2002年3月開始建立，基礎資料、化驗檢測、DNA提取及一部分不同基因的檢測、物理診斷檢查、CT、磁共振成像(MRI)等檢查，都陸續輸入庫中，AGT基因檢測2011～2012年進行〕。檢出曾患ACI者170例為ACI組：男132例，女38例；余1 820例無ACI者為對照組：男1 155例，女665例。診斷符合1995年全國第四屆腦血管病會議制定的ACI診斷標準〔2〕：①常安靜下發病；②多無明顯頭痛、嘔吐；③多逐漸進展，與腦動脈粥樣硬化有關；④一般發病后1～2 d內意識清楚或輕度障礙；⑤有頸內動脈系統和(或)椎-基底動脈系統癥狀和體征；⑥ACI診斷均經頭顱CT和(或) MRI證實。排除標準:①具有心臟瓣膜、房顫、腫瘤等明顯栓子來源的腦栓塞性疾病；②既往有腦出血病史；③肝腎功能不全、血液系統疾病患者；④1個月內有各種炎癥病史者。

1.2問卷調查 由經過培訓的專業人員采用面對面訪談形式填寫調查表。

1.3血脂等生化項目檢測與DNA的提取 抽取靜脈血8 ml，取其中的3 ml采用全自動生化分析儀(日立7600)測定血脂等生化指標。5 ml用EDTA-K2抗凝管抗凝，低滲法提取白細胞，Tris-飽和酚，氯仿/異戊醇法提取DNA。

1.4DNA擴增 應用聚合酶鏈反應(PCR)-限制性片段長度多態性(RFLP)方法進行基因型檢測。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。 引物參照文獻〔3〕上游5′-CGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTC-3′；下游5′-AGGGTGCTGTCCACACTGGACCC-3′。實驗方法及實驗參數參照文獻〔4，5〕：(AC為非配對堿基)AGT基因第2外顯子704位點T突變為C，產生一個適合酶切的半位點，與之相應的另一個“半位點”是通過2個非配對堿基(下劃線)的引入來完成，這2個非配對堿基并不影響引物的延伸。應用PE-9700擴增儀(美國PE公司)進行 PCR擴增。

1.5PCR反應體系和酶切體系 PCR反應體系總體積25 μl：無菌去離子雙蒸水13.2 μl，10×緩沖液2.5 μl，MgCl2溶液1.5 μl，dNTP混合物3 μl(2.5 pmol/μl)，上、下游引物2.5 μl(2.5 pmol/μl)，Taq酶0.8 μl (5 U/μl)，模板約0.5 μg(260∶280>1.7)。PCR反應條件 94℃預變性3 min，94℃變性30 s，66℃退火40 s，72℃延伸60 s，30個循環后延伸72℃10 min，結束反應。PCR產物酶切總體積20 μl：無菌去離子雙蒸水7.6 μl，緩沖液B 2 μl，PsyⅠ(亦稱Thr1 Ⅲ)內切酶2.4 μl(10 U/μl)，PCR擴增產物8 μl，37℃水浴過夜。反應終止后，酶切產物于2.5％瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察結果。

1.6DNA多態性分析 AGT基因電泳結果分型：AGT基因TT為野生型，因無酶切位點，顯示1條163 bp 的擴增片段，CC突變純合子有1個酶切位點則顯示兩條140、23 bp片段，TC為突變型雜合子，顯示163、140、23 bp 3條片段。

1.7統計分析 應用SPSS13.0軟件包，單因素分析采用χ2檢驗；基因型風險率以比數比(OR)及95％可信區間(95％CI)表示；以Logistic回歸進行危險因素分析，計算校正其他危險因素(包括吸煙、飲酒、體重指數、高血壓史、血脂、尿酸、血清蛋白、血糖等)后的OR值。

2 結 果

2.1AGT基因型與ACI的關系 突變純合子CC基因型的ACI患病風險增加了5.71倍，經過調整其他危險因素后，患病風險仍高達5.15倍(P<0.05)，見表1。

表1 AGT基因型與ACI患病

2.2年齡、性別與ACI的關系 不同年齡組之間患病率分布不同(P<0.001)；男性患病率高于女性(P<0.001)，見表2。

2.3按性別分層后AGT基因型與ACI關系的比較 男性人群中與攜帶TT基因型的人群相比，攜帶CC基因型的ACI患病風險增高了3.46倍；而女性人群增高了15.94倍，見表3。

2.4按年齡分層后AGT基因型與ACI關系的比較 在<65歲的人群中，與攜帶野生TT基因型的人群相比，攜帶突變CC基因型人群ACI患病風險增高了3.34倍，而在≥65歲人群中其風險增加6.49倍,見表4。

表2 年齡、性別與ACI的關系

表3 按性別分層后AGT基因型與ACI關系

表4 按年齡分層后AGT基因型與ACI的關系

3 討 論

ACI是一個包括環境、遺傳在內的多致病因素的綜合征，多數ACI患者都有家族史，提示遺傳因素在其發病中起一定作用，ACI的遺傳危險因素尚未完全確定。本研究結果表明AGT基因突變純合子CC基因型在人群中所占比例較低，但對ACI發病有較大影響，揭示AGT基因T704C多態性與ACI的相關性，遺傳因素對ACI的發生也不容忽視。而Sethi等〔6〕研究發現AGT基因T704C基因多態性在ACI組與對照組比較未顯示出統計學差異，造成結果不一致的原因考慮與不同種族及地理環境、人文環境等因素有關。

ACI危險因素分為可控制和不可控制因素，其中年齡為ACI的不可控危險因素，本研究顯示，隨年齡增長ACI患病率明顯增高。年齡逐漸增長，機體新陳代謝緩慢，各器官功能衰退，血液循環減緩，再加上缺乏體育鍛煉意識，機體則進入一個老化、衰退的生理狀況。同時血液垃圾得不到及時代謝，促進血栓形成，導致血管最終堵塞；糖、脂肪和蛋白質代謝紊亂，血中膽固醇大量增加，促使動脈硬化形成，進而發展為ACI〔7〕。本研究提示所調查人群中，男性ACI患病率明顯高于女性，可能與男性人群吸煙〔8，9〕、飲酒〔10〕等不良生活習慣相關，因此男性群體應對不良生活習慣引起足夠重視。亦可能與女性雌激素的保護作用有關〔11〕。本研究說明AGT基因多態性可能是女性的遺傳易感因素之一。不論年齡大小，AGT基因的CC基因型可能都是ACI患病遺傳易感因素之一。

4 參考文獻

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