按摩通過改善VEGF活性及血供促進兔骨骼肌損傷修復

謝 輝 唐成林 陳曉琳 唐念珍 韋貴勇

(重慶醫科大學中醫藥學院中醫藥研究室，重慶 400016)

肌肉鈍挫傷是肌肉損傷發生率最高的一種，常見于對抗性體育項目或意外事故〔1〕。對日常生活和繼續參加體育運動均造成不利影響〔2〕。對于老年人來講，跌撲損傷更易發生，影響正常體育活動，甚至影響正常生活。損傷造成機體部分細胞和組織喪失后，機體對所形成的缺損進行修補恢復的過程稱為修復，修復后可完全或部分恢復原組織的結構和功能。本文觀察骨骼肌挫傷愈合過程中形態和血管內皮生長因子(VEGF)的變化，探討按摩在骨骼肌挫傷恢復過程中的作用及其應用價值。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組和制模 實驗兔為純種健康成年雄性新西蘭大白兔42只，體重(2.0±0.5)kg，由重慶醫科大學實驗動物中心提供(醫學動物合格證SCXK渝20120001)，分籠飼養，適應性飼養7 d后被隨機分為正常組(A 組，n=3)、按摩前損傷組(B組，即損傷后第3天，n=3)、損傷后第5天按摩組(C組，n=9)和自然恢復組(D組，n=9)、損傷后第10天按摩組(E組，n=9)和自然恢復組(F組，n=9)。

采用重物打擊法制作兔股四頭肌急性損傷模型〔3〕。用自制底面平滑的重力鉛錘(錘長10 cm、重0.5 kg、直徑2.5 cm；塑料導向管長100 cm，直徑3.0 cm)進行重力打擊，為保證每只實驗兔所受撞擊力度和損傷范圍一致，由同一人執行每次的鉛錘投放和導管固定。造模成功的標準：肉眼可見打擊部位出現腫脹和淤血，同肌肉撞傷相似，無皮膚破裂及骨折。

1.2試劑和儀器 主要試劑：8％硫化鈉脫毛劑，Ⅰ抗：VEGF 抗體(北京博奧森)；Ⅱ抗：辣根過氧化物標記生物素(北京博奧森)；BCA蛋白定量試劑盒250次(上海貝博)。

主要儀器：酶標儀(Biocell，中國)；Chem Gel-DocXR凝膠成像分析系統(Bio-Rad)；電泳儀(DYY-6C，中國北京六一儀器廠)；AFY-10按摩器(天津京康瑞福科技發展有限公司)；荷蘭飛利浦公司產飛利浦iu22 高端彩超診斷儀(L12-5 高頻探頭，頻率10 MHz)。

1.3方法

1.3.1按摩干預 造模后第4天開始按摩治療〔4〕，對照組不進行。1次/d，15 min/次，按摩轉速為2 600 r/min，直接在受損組織及臨近部位按摩，直至處死取材。

1.3.2超聲檢查 經耳緣靜脈注射3％戊巴比妥鈉(25 mg/kg)對實驗兔行全身麻醉，經8％硫化鈉脫毛，在實驗臺上用膠布固定。造影劑于使用前注入3 ml雙蒸水，迅速振搖至其完全溶解，于耳緣靜脈注射，即刻對受損股四頭肌用飛利浦iu22高端彩超診斷儀進行局部超聲診斷，觀察并記錄回波圖像。

1.3.3取材與預處理 將實驗動物分別于損傷后第5、10天，空氣栓塞法處死。快速切取造模處股四頭肌，即刻對受損股四頭肌用預冷PBS清洗，縱切取4塊，將其中2塊(1.5 cm×1.0 cm×0.5 cm)肌組織標本，于4％多聚甲醛固定液固定過夜，用于H&E染色(固定組織經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，蘇木精和伊紅染色)。另2塊(約1.5 cm×1.0 cm×0.3 cm)標本立即置液氮冷凍，于-80℃低溫冰箱保存備用，用于Western印跡檢測。

1.3.4Western印跡檢測兔骨骼肌中VEGF表達 取股四頭肌樣本加入適量組織細胞裂解液，電動勻漿器攪碎，冰浴30 min裂解，12 000 r/min離心5 min后取上清，測定蛋白濃度。40 μg蛋白經10％ SDS-PAGE 電泳，電轉膜儀轉移至NC膜，麗春紅染色，有條帶則繼續下一步實驗。5％脫脂牛奶封閉，PBST 漂洗3次；加入Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜，取出Ⅰ抗，PBST漂洗3次，10 min/次；加入辣根過氧化物標記的Ⅱ抗，搖床輕搖1 h，TBST室溫脫色搖床上洗3次，每次10 min；將膜置入發光盤中，加入發光試劑( ECL)進行化學發光反應，Alpha軟件處理系統分析獲取目標蛋白、內對照蛋白的灰度密度值，目的條帶和內參照條帶的灰度比值評價各組VEGF的變化。

1.4統計學分析 采用SPSS17.0軟件，組間比較采用單因素方差分析，同組兩時間點比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1按摩對形態學的影響 光鏡下觀察，正常組肌纖維排列整齊，且大小一致(圖1A)。損傷后第3天組，肌纖維大量斷裂、崩解，部分萎縮，肌纖維明顯萎縮、扭曲、壞死，間隙明顯增大，炎癥反應明顯(圖1B)。損傷后第5天兩組肌纖維萎縮、壞死均明顯減輕，自然恢復組與按摩組相比炎癥反應仍較明顯，且肌纖維間隙較大、排列紊亂，可見明顯結締組織填充，而按摩組新生的肌纖維明顯較對照組多，且排列緊密(圖1C，1D)。損傷后第10天，按摩組肌纖維排列相比對照組更緊密整齊，肌纖維間見少量結締組織填充，同正常組逐漸較接近，而損傷后第10天自然恢復組肌纖維排列仍較紊亂，結締組織同肌纖維交織，顏色呈蒼白色，肌纖維之間仍有結締組織填充(圖1E，1F)。

A：正常組；B：傷后第3天組；C：傷后第5天按摩組；D：傷后第5天自然恢復組；E：傷后第10天按摩組；F：傷后第10天自然恢復組；下圖同

2.2按摩對損傷局部血供的影響 正常組(2A)肌肉血供良好；制模后第3天組(2B)可見大范圍的壞死組織，且內部無血液供應，無血管生成；制模后第5天按摩組(2C)顯示壞死范圍較自然恢復組(2D)減小，有部分微泡可見于壞死組織內部，表明壞死組織內部血管部分生成，其周圍微泡密度和亮度均較自然恢復組(2D)高。制模后第10天自然恢復組(2F)可見血液供應仍不佳，壞死范圍也明顯減少，但與按摩組(2E)仍有較大差別，此時按摩組(2E)只有微小的壞死組織，血液供應情況很好，與正常組織逐漸接近。

圖2 超聲微泡顯示結果

2.3按摩對VEGF表達量的影響 VEGF在正常組織中幾乎不表達，損傷后修復過程中各組與正常組(0.06)比較表達均顯著增多(P<0.01)。損傷后第3天組VEGF相對表達量(0.78)明顯高于正常組(P<0.01)，經過按摩干預后，損傷后第5天，按摩組VEGF表達水平(0.80)較自然恢復組(0.63)偏高(P<0.01)；同樣，損傷后第10天，VEGF在自然恢復組(0.20)表達水平明顯低于按摩組(0.27)(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組VEGF表達

3 討 論

血液循環系統在組織損傷修復過程中的作用是不可替代的。血管形成主要包括血管發生，血管生成和動脈生成3個過程〔5〕。骨骼肌損傷后，會造成局部缺血缺氧，在低氧和炎癥的刺激下巨噬細胞、T細胞、星形膠質細胞、周細胞、平滑肌細胞均能分泌VEGF〔6，7〕。VEGF及其受體是血管生成中最好的特色信號路徑〔8〕。我們前期的研究顯示，按摩可以改善血液“濃、粘、凝、聚”的狀態，加快血液流動，改善血液黏稠度，利于損傷區域充足血供，并減輕局部壞死，為組織細胞提供更多的血氧，有利于局部內環境的改善，減少了組織細胞的變性、壞死〔9〕。

VEGF是一種具有肝素結合活性的生長因子，作用于血管內皮細胞，在許多正常組織組織中廣泛存在，如腦、皮膚、肺、腎、心肌、骨骼肌和小腸等許多組織都有不同程度的表達，是具有高度特異的血管內皮細胞有絲分裂素。在我們的實驗中也可觀察到，正常組織中VEGF表達很少，損傷后其表達量迅速增加。VEGF的作用很多：①促進內皮細胞的增殖，是目前已知的作用最強的促血管生成因子。有研究表示，VEGF的表達與組織中微血管的密度及新生血管的數量密切相關〔10〕，可明顯促進拉傷處內皮細胞的增殖，在體內誘導血管形成，加快血管內皮的愈合〔11〕。②對血流動力學的影響。也有研究顯示，靜脈滴注VEGF可增加心率及心輸出量，降低血管外周阻力，對心肌收縮力無明顯的影響〔12〕。③抗血栓，還可促進血管內細胞的愈合，使內膜內皮化，間接地抗血栓形成〔13〕。

本文結果顯示，按摩組同自然恢復組相比，新生的肌纖維明顯較對照組多且排列緊密。在超聲檢查中，經按摩干預后，損傷部位的血液供應有了明顯改善，有新生血管生成，微泡密度和亮度均增高，壞死范圍也明顯減少。炎癥趨化因子可以促進VEGF的分泌〔15〕，進而作用于血管內皮細胞、刺激毛細血管網的增殖，增加氧的輸送〔16〕。VEGF也可通過p38MAPK 通路誘導表達，引起人臍靜脈內皮細胞的遷移〔17〕。對于這一機制仍需進一步探索和研究。

推拿手法能達筋骨節竅之血氣凝滯，甚至還能調節情志之苦欲，因而能夠通過筋骨節竅實現移精變氣。推拿具有適應面廣泛、手法操作較簡單、安全性高的特點；對神經系統、消化系統及循環系統有治療、調節、健體的功能；對運動系統有提高人體運動能力、消除運動疲勞的作用；對運動損傷的康復具有促進血液循環，改善供血，加速損傷組織修復、鎮痛、緩解痙攣肌群、關節歸順的功能；更對老年人有縮短療程、減輕痛苦、節省時間、節約開支的價值。

4 參考文獻

1Kasemkijwattana C，Menetrey J，Day CS，etal.Biological intervention in muscle healing and regeneration〔J〕.Sports Med Arthrosc Rev，1998;6(2)：95-102.

2Rouwkema J，Rivron NC，van Blitterswijk CA.Vascularization in tissue engineering〔J〕.Trends Biotechnol，2008;26(8)：434-41.

3劉仁建，唐成林，鄒 敏,等.按摩抑制兔鈍挫傷骨骼肌瘢痕形成的機制研究〔J〕.中華物理醫學與康復雜志，2012;34(10)：742-6.

4石茜明，王學禮，按摩對肌肉損傷修復作用的形態學研究〔J〕.中國運動醫學雜志，1991;10(4)：201-5.

5Carmehet P.Manipulating angiogenesis in medicine〔J〕.J Intern Med,2004;255(5)：538-61.

6McClung JM，McCord TJ，Keum S，etal.Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice〔J〕.Am J Pathol,2012；180(5)：2156-69.

7Qasi Y，Maddula S，Ambati BK.Mediators of ocular angiogenesis〔J〕.J Genet，2009;88(4)：495-515.

8劉林奇，魯 峰，高建華.血管內皮生長因子參與血管形成的機制研究進展〔J〕.中華實驗外科雜志，2012;29(4)：770-2.

9郜 婕，唐成林，鄒 敏,等.穴位按摩對受損骨骼肌血管內皮生長因子表達、微泡超聲造影及血液流變的影響〔J〕.中華物理醫學與康復雜志，2013;35(2)：91-6.

10Maeda K，Chung YS，Ogawa Y，etal.Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma〔J〕.Cancer，1996;77(5)：858-63.

11Asabara T，Bauters C，Plastore C，etal.Local delivery of vascular endothelial growth factor accelerates reendothelialization and attenuates intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery〔J〕.Circulation,1995;91：2793-801.

12祁 明，鄭亞寧.血管內皮生長因子的研究進展〔J〕.青海師范大學學報，2010;26(4)：61-6.

13周 泉.血管內皮生長因子的生物學特性及臨床研究進展〔J〕.實用心腦肺血管病雜志，2001;9(1)：51-4.

14彭 芳，陳 明.抗血管生成和腫瘤血管正常化的研究進展〔J〕.中國肺癌雜志，2009;12(7)：799-804.

15Pugh CW，Rateliffe PJ.Regulation of angiogenesis by hypoxia：role of the HIF system〔J〕.Nat Med,2003;9：677-84.

16Yu J，Bian D，Mahanivong C，etal.p38 mitogen-activated protein kinase regulation of endothelial cell migration depends on urokinase plasminogen activator expression〔J〕.J Biol Chem，2004;279(48)：50446-54.