單次負荷劑量瑞舒伐他汀預(yù)處理對再灌注損傷挽救激酶信號通路的影響和心肌保護

王 凌 林 榮 潘國焰 吳 兵

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院心內(nèi)科，福建 泉州 362000)

研究證實他汀類藥物較長時間持續(xù)應(yīng)用能減少缺血再灌注損傷，但關(guān)于他汀短期用藥尤其是單次負荷劑量療效的基礎(chǔ)研究甚少，經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)術(shù)前給予負荷劑量的某些他汀類藥物治療可以減輕心肌損傷〔1〕，其機制推測部分可能與減輕缺血再灌注損傷有關(guān)；而有關(guān)單次負荷劑量瑞舒伐他汀缺血前預(yù)處理對再灌注損傷影響的基礎(chǔ)研究目前罕見報道。本實驗通過再灌注前給予單次負荷劑量瑞舒伐他汀觀察其能否減輕在體家兔心肌缺血再灌注損傷，并探討其對再灌注損傷挽救激酶(RISK)信號通路的影響及潛在的心肌保護機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用84只健康成年雄性大耳白兔(由福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，體重2.5～3.0 kg，兔齡120～140 d。

1.2主要制劑 瑞舒伐他汀鈣原粉(浙江昌明藥業(yè)有限公司)；TTC染色劑、伊文思藍、LY294002、PD98059(均購自美國Sigma公司)，P-蛋白激酶B(Akt)、Akt、P-細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、ERK1/2抗體(均購自美國Santa Cruz公司)。

1.3制備兔缺血/再灌注模型 借鑒文獻〔2〕，將家兔麻醉后固定，連接LEAD2000多導(dǎo)生理儀記錄進行心電監(jiān)護并記錄肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。經(jīng)胸骨左緣2～4肋開胸并剪開心包，尋找冠狀動脈左室支(多沿左心耳下行至心尖處)并于其近段附近以6～0細針線穿過左室支下方，進針深度約0.3 mm，線兩側(cè)穿入同一根橡皮小管以形成閉環(huán)，拉緊閉環(huán)即造成冠脈閉塞，導(dǎo)致局部心肌缺血，直視下可觀察到左室支供血區(qū)域的心肌顏色由紅色變?yōu)榘祷疑笫蚁隆⒑蟊谛募〔珓用黠@減弱，同時心電圖出現(xiàn)明顯的ST段弓背向上型抬高(Ⅱ、Ⅲ、avF導(dǎo)聯(lián))，回撤松開閉環(huán)即可使局部心肌恢復(fù)再灌注。

1.4實驗分組 隨機均分成7組，每組12只。假手術(shù)組僅開胸而不進一步處理，術(shù)前12 h靜脈注射生理鹽水1 ml/只；對照組(缺血再灌注組)術(shù)前12 h靜脈注射生理鹽水1 ml/只；RS組術(shù)前12 h靜脈注射RS 5 mg/kg(用生理鹽水溶解，溶成1 ml)；RS+LY294002組術(shù)前12 h靜脈注射RS 5 mg/kg，再灌注前5 min注射LY294002(0.3 mg/kg)；LY294002組再灌注前5 min靜脈注射LY294002(0.3 mg/kg)；RS+PD98059組術(shù)前12 h靜脈注射RS 5 mg/kg，再灌注前5 min注射PD98059(0.3 mg/kg)；PD98059組再灌注前5 min靜脈注射PD98059(0.3 mg/kg)。7組體重、兔齡無顯著性差異(P>0.05)。

1.5觀察指標 ①心電圖。常規(guī)描記缺血前、缺血5、20、40 min和再灌注10、30、60、120、180 min時肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖，觀察并記錄實驗全程發(fā)生的各種心律失常情況。②心肌缺血范圍=梗死范圍測定。實驗結(jié)束原位結(jié)扎左室支，抽取2％伊文思藍2～3 ml注入左心室，非缺血心肌被染成藍色，缺血區(qū)心肌因無灌注而不被染色(無藍染)。注射10％氯化鉀使心臟停搏并立即摘取心臟，仔細分離左心室染色區(qū)和非染色區(qū)，稱重后將非染色區(qū)(缺血區(qū))置-20℃冰凍保存5 min后，沿左心室長軸橫切為5～6片厚約2 mm的心肌片，先置于1％TTC磷酸緩沖液中，后置于37℃恒溫進行水浴，缺血區(qū)因TTC被脫氫酶還原而呈現(xiàn)深紅色，梗死區(qū)因TTC無法被還原而呈灰白色，染色結(jié)束后用蒸餾水沖洗，隨后置于4％多聚甲醛中固定12 h，根據(jù)局部顏色差異進一步將梗死區(qū)和非梗死區(qū)分離，吸干后分別稱重。心肌缺血范圍以缺血區(qū)心肌重量/左室重量×100％，心肌梗死范圍=壞死區(qū)心肌重量/缺血區(qū)心肌重量×100％來表示。

1.6Western印跡法檢測Akt、P-Akt、ERK1/2及P-ERK1/2蛋白的表達 分離左心室缺血區(qū)心肌，用預(yù)冷PBS液洗滌后稱取100 mg心肌組織，在液氮中研磨成粉末，加入1 ml單去污劑裂解液，充分裂解細胞后，置12 000 r/min離心15 min，分離收集上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肂CA蛋白定量試劑盒進行心肌組織蛋白定量。各取50 μg待測蛋白樣品進行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至NC膜上，5％脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入相應(yīng)的Akt、P-Akt、ERK1/2、P-ERK1/2抗體(均為1∶1 000)4℃孵育過夜，PBST洗滌后加入稀釋1：2 500的二抗室溫孵育1 h，洗滌瀝干后加入ECL Plus試劑進行ECL顯影。最后用Leica圖像分析軟件測定圖片上每個特異性條帶灰度值。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組心肌缺血范圍及梗死范圍比較 與對照組比較，各組缺血心肌范圍均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；RS組心肌梗死范圍明顯降低(P<0.05)，其余各組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組心肌缺血范圍及梗死范圍比較

2.2各組Akt、P-Akt、ERK1/2及P-ERK1/2蛋白的表達 與假手術(shù)組比較，對照組P-Akt、P-ERK1/2水平明顯增加(P<0.05)；RS組P-Akt、P-ERK1/2水平比對照組明顯增加(P<0.05)；RS+LY294002、LY294002組P-Akt及RS+PD98059、PD98059組P-ERK1/2的水平較RS組均明顯降低(P<0.05)。見圖1和表2。

a.假手術(shù)組；b.對照組；c.RS組；d.RS+LY294002組；e.LY294002組；f.RS+PD98059組；g.PD98059組

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與對照組比較：2)P<0.05；與RS組比較：3)P<0.05

3 討 論

瑞舒伐他汀是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類親水性他汀，相較其他他汀類，其水溶性和降低低密度脂蛋白(LDL)的效果更強。Ke等〔7〕發(fā)現(xiàn)RS能通過誘導(dǎo)CD4、CD25調(diào)節(jié)性T細胞而發(fā)揮對缺血再灌注損傷保護作用，Wu等〔8〕等近期發(fā)現(xiàn)單次負荷劑量RS能通過抑制氧化應(yīng)激和高遷移率族蛋白(HMGB)1，減少兔心梗面積。Jiang等〔9〕等發(fā)現(xiàn)急性冠脈綜合征患者PCI術(shù)前單次負荷劑量的RS(40 mg/d)能有效抑制PCI術(shù)后再灌注心肌損傷，其機制與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。

RISK信號通路是指一組促存活蛋白激酶，主要包括磷脂酰肌醇-3激酶(P13K)，Akt和Erkl/2。PI3K/Akt是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活后可進入細胞質(zhì)和細胞核，誘導(dǎo)內(nèi)皮型氧化亞氮合酶(eNOS)及調(diào)節(jié)p70s6K、糖原合成激酶-3B，抗凋亡因子Bcl-2的表達，進而抑制線粒體可滲透轉(zhuǎn)運孔隙(mPTP)的開放，或通過影響蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯而發(fā)揮作用。后者系絲裂素活化蛋白激酶家族中成員之一，激活后可通過磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，或觸發(fā)了細胞內(nèi)抗凋亡信號機制而產(chǎn)生心肌保護作用〔10，11〕。目前的研究發(fā)現(xiàn)，該信號系統(tǒng)的激活正是缺血預(yù)適應(yīng)和缺血后適應(yīng)所介導(dǎo)的心肌保護的重要機制〔12～14〕；Hausenloy等〔10〕對大鼠心肌進行缺血預(yù)處理研究時發(fā)現(xiàn)再灌注前多次心肌缺血可誘導(dǎo)Akt和ERK1/2的磷酸化水平升高，并縮小心肌梗死面積，應(yīng)用相應(yīng)的抑制劑抑制PI3K/Akt和ERK1/2磷酸化則無法縮小心梗面積。Fujita等〔14〕等對大鼠進行缺血后適應(yīng)研究也發(fā)現(xiàn)后者可激活ERK1/2磷酸化，應(yīng)用ERK1/2的抑制劑可以取消后適應(yīng)所帶來的心肌保護作用。

本研究表明再灌注能誘導(dǎo)RISK信號通路活化；提示RS單次負荷劑量的確可產(chǎn)生再灌注心肌保護，其機制可能與RISK進一步激活有關(guān)，RS所產(chǎn)生的有益影響可被PI3K抑制劑或ERK1/2抑制劑抵消，證實了PI3K/Akt和ERK1/2通路激活在RS組心肌保護中起重要作用。提示單獨使用PI3K抑制劑和ERK1/2抑制劑或即使合用RS均不能產(chǎn)生足夠的心肌保護。綜上，單次負荷劑量RS預(yù)處理可能通過激活RISK信號通路對心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護作用。但RISK信號通路中Akt與ERK1/2之間的關(guān)系及其深層機制仍待研究明確。

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