不同年齡組抑郁癥模型大鼠Meynert基底核神經(jīng)元凋亡

宮國(guó)良 張?jiān)?周昭杰 張曉杰

(汕頭潮南民生醫(yī)院病理科，廣東 汕頭 515144)

世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球現(xiàn)有抑郁癥患者3.4億，在10大疾病排位中已上升為第5位〔1〕。研究認(rèn)為抑郁癥是一種多基因疾病，是在遺傳因素基礎(chǔ)上，在環(huán)境因素的應(yīng)激作用下，使基因易損個(gè)體腦內(nèi)特定部位，主要是邊緣系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞凋亡與再生共扼平衡失調(diào)，引起的以情緒改變?yōu)橹鳎橛忻庖邇?nèi)分泌功能改變和其他神經(jīng)功能異常的精神疾病〔2〕。Meynert基底核是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，是新皮層膽堿能神經(jīng)支配的主要來(lái)源，并被認(rèn)為是情緒-動(dòng)機(jī)中樞與大腦皮層之間的膽堿能轉(zhuǎn)換站。研究顯示〔3〕，Meynert基底核膽堿能神經(jīng)元及其遞質(zhì)乙酰膽堿與抑郁癥的發(fā)病有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)選取膽堿能神經(jīng)元中樞-Meynert基底核進(jìn)行抑郁癥發(fā)病過(guò)程中神經(jīng)元的凋亡情況的研究，并探討凋亡與年齡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔許可證編號(hào)SCXK(京)2007-0001〕。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BIPE公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，EM-208S型透射電鏡(荷蘭飛利浦公司)。

1.2動(dòng)物模型制備 通過(guò)敞箱實(shí)驗(yàn)每組選擇評(píng)分相近的32只，分別進(jìn)入同年齡組的模型組與對(duì)照組。單籠飼養(yǎng)，對(duì)照組正常飼養(yǎng)，不加任何刺激。模型組應(yīng)用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激制作動(dòng)物模型〔4〕，包括：禁食24 h，禁水24 h，夾尾1 min，4℃冰水游泳5 min，電擊足底(30 v，10 s/次，間隔10 s，共10次)，束縛應(yīng)激6 h，鼠籠傾斜24 h，60℃烘烤15 min，振蕩30 min。每日給予一種刺激，每種刺激累計(jì)使用2～3次，順序隨機(jī)，使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生，共計(jì)21 d。

1.3抑郁癥模型評(píng)價(jià) 在實(shí)驗(yàn)前1 d及實(shí)驗(yàn)第21天，用敞箱實(shí)驗(yàn)和糖水偏愛度實(shí)驗(yàn)觀察各組大鼠行為的變化。實(shí)驗(yàn)時(shí)將單只大鼠置于100 cm×100 cm×50 cm光潔敞箱中央，敞箱底面分為25個(gè)等邊方格，記錄大鼠5 min內(nèi)水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分。禁食禁水24 h后，進(jìn)行糖水偏愛度實(shí)驗(yàn)，每籠同時(shí)給予 2個(gè)水瓶，1瓶裝 1％蔗糖水，1瓶裝純水，60 min后稱量糖水及純水消耗量，計(jì)算糖水偏愛度。

1.4Meynert基底核神經(jīng)元細(xì)胞凋亡檢測(cè) 最后一次行為測(cè)試結(jié)束后，每組隨機(jī)抽取8只大鼠，速斷頭取腦，參照大鼠腦立體定位圖譜〔5〕，在冰塊上切取Meynert基底核。將Meynert基底核組織剪碎，利用流式細(xì)胞制備儀研磨成細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度約1×106個(gè)/ml，參照試劑盒說(shuō)明，加入10 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI，混勻避光孵育15 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液后上機(jī)檢測(cè)。

1.5透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 行為測(cè)試結(jié)束后，每組隨機(jī)抽取5只大鼠，各組大鼠所取腦組織投入到2.5％戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定24 h，四氧化鋨后固定2 h，乙醇、丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂812包埋組織塊，修塊制成1 μm半薄切片，1％ NaOH無(wú)水乙醇軟化，光鏡定位，并精修制備超薄切片，用KCQ-1型超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重電子染色，EM-208S型透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS14.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組曠場(chǎng)行為、糖水消耗量比較 經(jīng)過(guò)21 d慢性應(yīng)激后，模型組水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分、糖水消耗量顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，且14～15月齡模型組顯著低于4～5周齡和4～5月齡模型組(水平運(yùn)動(dòng)得分t值分別為9.400、6.084，垂直運(yùn)動(dòng)得分t值分別為7.841、9.036，糖水消耗量t值分別為14.604、18.778，P均<0.01)。見表1。

2.2各組Meynert基底核細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果 4～5周齡、4～5月齡、14～15月齡模型組較對(duì)照組細(xì)胞凋亡率明顯增加〔(16.86±2.41)％ vs (7.26±1.33)％、(17.90±2.29)％ vs (8.02±0.95)％、(27.91±4.64)％ vs (8.87±9.38)％，均P<0.01〕。14～15月齡模型組細(xì)胞凋亡率與4～5周齡、4～5月齡模型組組間差異顯著(t值分別為7.06、5.975，P均<0.01)，4～5周齡與4～5月齡模型組差異不顯著(t=0.885，P>0.05)。

2.3各組Meynert基底核透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)結(jié)果 對(duì)照組隨年齡增長(zhǎng)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)逐漸減少，凋亡細(xì)胞增加，均呈早期凋亡表現(xiàn)。各模型組均可見細(xì)胞胞核固縮，線粒體嵴斷裂呈絮狀變性，神經(jīng)元尼氏體崩解脫顆粒，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，脂褐素沉積，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、壞死。凋亡神經(jīng)元細(xì)胞核膜下異染色質(zhì)邊集，核固縮，細(xì)胞器變性，膜性結(jié)構(gòu)完整。且隨年齡增長(zhǎng)細(xì)胞器變化明顯，凋亡逐漸增加，以14～15月齡模型組最重(圖1)。

表1 各組敞箱實(shí)驗(yàn)水平得分、糖水消耗量比較

4～5周齡對(duì)照組(×8 000)

4～5周齡模型組(×6 300)

4～5月齡對(duì)照組(×5 000)

4～5月齡模型組(×6 300)

14～15月齡對(duì)照組(×6 300)

14～15月齡模型組(×16 000)

3 討 論

細(xì)胞數(shù)量的生物穩(wěn)態(tài)是通過(guò)細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡之間的平衡來(lái)維持的，其中細(xì)胞凋亡又稱為程序化細(xì)胞死亡，是神經(jīng)生長(zhǎng)發(fā)育和衰老及維護(hù)其正常結(jié)構(gòu)與功能的重要機(jī)制之一〔6～8〕。研究已證實(shí)，慢性應(yīng)激導(dǎo)致抑郁癥發(fā)病，然而對(duì)于其發(fā)病機(jī)制尚存在不同觀點(diǎn)，一般認(rèn)為，在慢性應(yīng)激過(guò)程中多種神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制的缺失、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的活躍，是導(dǎo)致大腦器質(zhì)性損害的主要原因〔9〕，從而引發(fā)抑郁發(fā)作。研究發(fā)現(xiàn)〔3〕，抑郁癥模型鼠存在Meynert基底核神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的改變及其遞質(zhì)乙酰膽堿的變化。

本實(shí)驗(yàn)采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激動(dòng)物模型，該模型在每個(gè)個(gè)體的使用過(guò)程中都會(huì)存在或多或少的改變，但機(jī)制是相同的。由于慢性應(yīng)激采用了多變的令動(dòng)物不愉快的應(yīng)激方式，并且每種應(yīng)激的實(shí)施是不可預(yù)知完全隨機(jī)的，類似于人們?nèi)粘Ｉ钪性庥龅母鞣N突發(fā)性應(yīng)激事件，因此較好地模擬了抑郁癥發(fā)生的環(huán)境誘因。

本實(shí)驗(yàn)表明伴隨機(jī)體衰老，大鼠對(duì)新環(huán)境的好奇心及適應(yīng)能力逐漸下降，表現(xiàn)出一種淡漠情緒。在刺激強(qiáng)度相同條件下，年齡的增長(zhǎng)導(dǎo)致抑郁癥模型行為學(xué)變化更顯著，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道也相符合〔10〕。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果與電鏡結(jié)果均證實(shí)抑郁癥模型鼠存在明顯細(xì)胞凋亡，且隨年齡增長(zhǎng)凋亡增加。表明：Meynert基底核參與了抑郁癥的發(fā)病過(guò)程，其機(jī)制可能由神經(jīng)元凋亡引起，且隨年齡增長(zhǎng)凋亡增加。機(jī)體對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)性及耐受性和年齡有密切關(guān)系，Selye〔11〕在1970年提出了關(guān)于衰老的應(yīng)激學(xué)說(shuō)，認(rèn)為應(yīng)激可加速衰老過(guò)程，此后應(yīng)激和衰老之間的關(guān)系開始受到重視。老齡大鼠對(duì)慢性應(yīng)激的敏感性增強(qiáng)，應(yīng)激損傷更加嚴(yán)重，主要表現(xiàn)在對(duì)新環(huán)境缺乏探索興趣，興奮性及適應(yīng)能力明顯降低。衰老動(dòng)物對(duì)慢性應(yīng)激的敏感性較高，因此，應(yīng)激損傷更加嚴(yán)重。綜上，Meynert基底核神經(jīng)元凋亡與抑郁癥發(fā)病相關(guān)，且此種形態(tài)改變與年齡的變化有密切關(guān)系。

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