早期胃癌中原代細胞ssDNA適配子檢測的臨床意義

徐 攀 馬 馳 張雪燕 楊曉娟 蔣 丹 聶登梅 劉 昕 韓躍武

目前胃癌臨床治療主要以手術治療為主，根據近年來的臨床調查結果顯示[1-2]，中晚期胃癌患者其術后的生存狀況并不理想，因此早期胃癌的診斷對患者的療效以及術后的生存狀況有著重要的意義。本研究通過建立早期胃癌原代細胞ssDNA適配子的檢測方法并進行臨床評價，同時對其作為診斷早期胃癌標準的診斷性能進行分析，旨在建立積極有效且適用于基層醫院的檢測方法，為臨床早期胃癌診斷提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究方法[3-6]

1.1.1 早期胃腺癌細胞表面特異標志物(靶物質)的捕獲、分離 ①早期胃腺癌細胞表面靶物質的分離提取：采取數例早期胃腺癌組織標本，利用原代細胞分離、純化方法及生物素——鏈酶親和素磁珠方法，分離提取與生物素化的適配子特異性結合的靶物質(即膜分子標志物)。②采用層析法分離、純化得到目標靶物質——分子標志物：首先對上一步提取的靶物質進行SDS-PAGE電泳，以正常胃黏膜細胞膜提取物作為對照，確定早期胃腺癌原代細胞靶物質的大致分子量。

1.1.2 標志物的分析與鑒定 ①應用常規方法確定分子標志物化學屬性(即是糖蛋白、脂蛋白還是糖脂等)：應用高碘酸-硝酸銀染色法鑒定電泳凝膠中的糖蛋白；運用瓊脂糖凝膠電泳，進行油紅O染色和氨基黑10B染色可以鑒定脂蛋白；采用5-甲基間苯二酚顯色，加熱糖脂可顯出紫紅色。②運用電泳、層析及HPLC方法純化5種靶物質，確保達到質譜分析所要求的純度：利用質譜檢測，經NCBInr數據庫搜尋進行比對分析，確定所獲得的分子標志物的理論分子量、等電點及結構等基本參數。

1.1.3 早期胃腺癌診斷方法的建立 ①對于每一種適配子所捕獲的分子標志物進行分析，可得到每一種分子標志物的相關參數，根據理想腫瘤標志物的選擇標準選擇1種標志物作為診斷的靶點。②以腫瘤標志物建立檢測方法：根據標志物的屬性，分析其免疫原性，制備單克隆抗體，然后依據此抗體建立3種檢測方法：① sp法免疫組化技術檢測方法；② 組織裂解免疫發光的檢測方法；③ 血清學檢測方法建立酶聯免疫發光測定法。

1.1.4 檢測方法的臨床評價 實驗方法的評價，以美國臨床實驗室標準化組織(clinical and laboratory standards institude，CLSI)的相關標準為依據，進行該方法的性能評估實驗，主要實驗指標包括：敏感性、特異性、陽性似然比、陰性似然比、干擾實驗、驗前比和驗后比。實驗的診斷性能評價，參考《臨床檢驗方法學評價》(ISBN：9787117105811 )，以本項目建立的方法為候選方法，以金標準為參考方法，進行方法學比較。評價指標包括靈敏度、特異性、準確度、精確度等。

1.2 主要試劑

膠原酶Ⅳ型、考馬斯亮藍、高碘酸、硝酸銀、5-甲基間苯二酚均購置生工生物工程(上海)股份有限公司；Promega鏈酶親和素磁珠及磁力架購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司；其它試劑為國產或進口分析純，0.5 mol/L EDTA(pH8.0),20%(W/V)Glucose,30%丙烯酰胺，5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，4×SDS-蛋白上樣緩沖液。

1.3 胃癌原代細胞ssDNA適配子的篩選及優化

應用0.1%膠原酶Ⅳ型溶液分離得到的早期胃腺癌原代細胞和正常胃黏膜上皮細胞純度均在90%以上，篩選前經PCR擴增條件優化，確定了其最佳的退火溫度為46℃，循環次數為15次。經過12輪篩選后，得到的ssDNA次級文庫與早期胃腺癌的結合率達到較高水平。

1.4 統計學方法

應用SPSS 15.0軟件進行統計學分析，計數資料比較采用χ2檢驗，以P<0.05作為有統計學差異的標準。

2 結果

2.1 評價結果

以美國臨床實驗室標準化組織(CLSI)的相關標準為依據，對實驗方法的敏感性、特異性、陽性似然比、陰性似然比、干擾實驗、驗前比和驗后比方面進行評價，結果顯示早期胃癌中原代細胞ssDNA適配子的檢測敏感性為49.13%，特異性為91.44%，陽性似然比為5.74，陰性似然比為0.56 g，干擾實驗51.8%，驗前比65.7%，驗后比197.2%。

2.2 診斷性能評價結果

根據《臨床檢驗方法學評價》，以本項目建立的方法為候選方法，以金標準為參考方法，從靈敏度、特異性、準確度、精確度方面進行比較，見表1。結果顯示，早期胃癌中原代細胞ssDNA適配子的檢測結果與金標準相比，在敏感性、特異性、準確度和精確度方面均無明顯差異(P>0.05)，無統計學意義。

表1 診斷性能評價結果/%

3 討論

ssDNA適配子是運用SELEX技術篩選所得到的1種寡核苷酸分子，其具有針對靶物質的特異性和較強的親和力[5]，而通過PCR擴增可以使寡核苷酸文庫中的核酸序列更加豐富，本研究的前期實驗結果已證實[7]，應用膠原酶Ⅳ型溶液能成功分離出原代細胞，而且純度較高，可以作為1種細胞分離的方法應用于后期研究。利用cell-SELEX技術能夠針對早期胃腺癌原代細胞篩選出特異性的適配子，并且適配子的結構較完整，二級結構預測中莖環結構可能是適配子與靶細胞結合的結構基礎。實驗采用熒光素修飾適配子的方法能成功的測定適配子與早期胃腺癌細胞結合的特異性和親和力。在測試的結果中發現，培養狀態下的細胞株與從組織中分離獲得的細胞在和適配子結合的時候，兩者的熒光強度值具有統計學意義。采用生物素修飾適配子，結合鏈霉親和素磁珠分離系統，能夠從早期胃腺癌原代細胞表面分離出特異的分子標志物，得知分子標志物的大致分子量，并可以確定細胞膜分子標志物有蛋白質成份。在此基礎上我們以美國臨床實驗室標準化組織(CLSI)的相關標準為依據，對該檢測方法的敏感性、特異性、陽性似然比、陰性似然比、干擾實驗、驗前比和驗后比，并與金標準為參考方法，在靈敏度、特異性、準確度、精確度方面進行方法學比較，其結果表明早期胃癌原代細胞ssDNA適配子檢測方法的敏感性為49.13%，特異性為91.44%，陽性似然比為5.74，陰性似然比為0.56 g，干擾實驗51.8%，驗前比65.7%，驗后比197.2%，并且與金標準相比，在敏感性、特異性、準確度和精確度方面均無明顯差異(P>0.05)，不具有統計學意義。由此，我們認為早期胃癌原代細胞ssDNA適配子的檢測，具有較高的靈敏度和較強的特異性，為早期胃癌的臨床檢測提供了相應的依據，可考慮作為早期胃癌的輔助診斷標準之一。

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[5] 曹立亭，許李麗，萬 向，等.SELEX 技術中ssDNA 文庫PCR擴增條件的優化〔J〕.安徽農業科學，2012，40(6)：3241-3242.

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[7] 郭 鵬，習 靜，張雪燕，等.早期胃腺癌原代細胞適配子的篩選與鑒定〔J〕.中國生物化學與分子生物學報，2013,29(3)：250-256.