早勝牛類群A-FABP基因SNPs及其與胴體品質和肉質性狀的相關性分析

唐紅杰 趙生國 雷趙民 王欣榮 王建福 蔡原 吳建平

脂肪型脂肪酸結合蛋白（A-FABP）屬于脂肪酸結合蛋白家族，是脂結合蛋白超家族的成員。A-FABP（Adipocyte fatty acid binding-protein）基因，也稱為Ap2、ALBP或FABP4，主要在脂肪細胞中表達，在甘油三酯形成及脂解過程中參與調控脂生成或溶解的生化過程［1］。牛A-FABP基因定位于牛14號染色體［2］，DNA 全長 4391bp，mRNA 全長 625bp，編碼132個氨基酸。關于雞［3］、豬［4］等畜禽的研究表明，A-FABP基因能夠增加肌內脂肪含量，且只在脂肪組織中表達。多態性的研究表明，雞［5，6］、鴨［7］、豬［8］、牛［9-11］A-FABP 基因多態性與肌內脂肪沉積相關，可作為牛肉大理石花紋和肌間脂肪（IMF）含量等肉質性狀的侯選基因［1，12］。A-FABP基因的突變對“日本和牛×利木辛牛”F2雜種牛的大理石花紋、皮下脂肪厚度［10］、牛背部脂肪厚度［13］及朝鮮牛大理石花紋［14］都存在相應的影響。鑒于A-FABP基因在脂質代謝過程中的重要作用，本研究以5個甘肅早勝牛類群為研究對象，利用PCR-SSCP技術，對A-FABP基因外顯子3進行多態性檢測，并分析多態位點與肉質性狀的相關性，旨在找出與生產性狀相關的遺傳標記，為選育優良肉牛提供遺傳學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品來源及基因組DNA提取 采集的牛耳組織樣（表1），置于盛有75％酒精的5mL EP管中，-20℃保存。采集的牛頸靜脈血樣6-8mL，加入1mL ACD抗凝劑，-20℃保存。用酚/氯仿法提取耳組織和血液基因組DNA［15］，TE溶解，并用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢驗DNA的純度和濃度，然后稀釋成100 ng/μL備用。

表1 樣品信息

1.1.2 肉用性狀指標 隨機選取平涼類群37頭和西雜牛32頭進行胴體性狀（宰前活重，胴體重，屠宰率，凈肉率，胴體背膘厚，眼肌面積）和肉質性狀（失水率，大理石花紋等級，肉色，剪切力，pH和蒸煮損失）測定，所檢測牛為相同管理條件下無親緣關系的22月齡健康公（閹）牛，肉用性狀的測定方法參照《養牛學》［16］。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與PCR反應體系 根據EMBL（ENSBTAT00000000079）公布牛A-FABP基因全序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計A-FABP基因外顯子3引物，預期擴增片段長度219bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列 F：5'-ATTATCCCCACAGAGCATCG-3'，R：5'-TTTTCATTCTACAAGGGCGATT-3'，PCR反 應 體 系為 25μL ：其 中 Premix Taq 12.5μL（1.25U），DNA模版 1μL（100ng/μL），上下游引物各 0.5μL（10 pmol/μL），ddH2O 10.5μL。反應條件 ：94℃預變性 3min；94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環；72℃延伸10min，4℃保存。

1.2.2 PCR產物檢測、變性及SSCP檢測 PCR產物采用1％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。取2μL PCR擴增產物，加入8μL變性上樣緩沖液（98％去離子甲酰胺、10mmol/L EDTA（pH8.0）、0.025％二甲苯氰FF、0.025％溴酚藍），98℃變性10min，冰浴10min，采用 14％ 丙烯酰胺凝膠（（Acr∶Scr=29∶1）進行檢測，180V電泳10h結束后銀染。

1.2.3 序列測定及分析 根據SSCP分析結果，挑選不同基因型的PCR擴增產物送上海生工生物工程有限公司進行純化并測序。用MEGA5軟件將測序結果與GenBank（NM-174314.2）序列進行比對。

1.2.4 數據統計分析 運用PopGen32軟件計算基因型頻率、等位基因頻率、純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數（Ne）、并進行群體內基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗，采用PIC軟件計算多態信息含量（PIC）；用卡方獨立性檢驗分析基因型在種群間的分布，并配合下列模型進行最小二乘方差分析，比較各性狀在不同基因型之間的差異，用SPSS19.0的一般線性模型（General linear model，GLM）過程完成。統計模型為：Yij=μ+GENi+GROj+（GEN×GRO）ij+eij其中，Yij為個體某性狀表型值；μ為群體均值；GENi為基因型效應；GROj為類群效應；（GEN×GRO）ij為基因型與類群的互作效應；為eij為隨機誤差。

2 結果

2.1 A-FABP基因PCR產物擴增結果

牛A-FABP基因PCR擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），片段條帶清晰，無雜帶，特異性較好，可用于SSCP檢測。

圖1 A-FABP基因PCR擴增產物檢測

2.2 SSCP電泳結果及測序分析

SSCP結果（圖2）發現3種帶型，推測為3種基因型，3種基因型的測序結果與NCBI數據庫公布的原始序列（NM-174314.2）進行比對，結果在A-FABP基因第3外顯子G408＞C處發現一個突變位點，即G→C堿基突變（圖3）。

圖2 A-FABP基因SSCP檢測結果

2.3 A-FABP基因遺傳多態性分析

根據SSCP檢測結果進行分析發現（表2），除西雜牛GC基因型頻率高于GG基因型頻率外，其他4個類群GC基因型頻率均低于GG基因型頻率，高于CC基因型頻率。在5個早勝牛類群中，G等位基因頻率均高于C等位基因型頻率為優勢等位基因。χ2適合性檢驗表明，慶陽類群和秦雜牛c.408G＞C位點χ2值達到顯著水平，表明其基因型分布處于Hardy-Weinberg非平衡狀態（P＜0.05），而其他3個類群的基因型分布處于Hardy-Weinberg平衡狀態（P＜0.05）。

χ2獨立性檢驗結果（表3）表明，西雜牛與平涼類群基因型分布差異顯著（P＜0.05），與慶陽類群、秦雜牛、南雜牛差異極顯著（P＜0.01）；其他類群間基因型分布差異不顯著（P＞0.05）。

A-FABP基因c.408G＞C位點在5個類群中的純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數（Ne）和多態信息含量（PIC）見表4。慶陽類群和平涼類群PIC＜0.25，處于低度多態。其他3個類群均處于中度多態（0.25＜PIC＜0.5）。

2.4 基因型與胴體、肉質性狀的相關性分析

圖3A-FABP基因不同基因型序列分析

對屠宰牛的6個胴體性狀（包括宰前活重、胴體重、屠宰率、凈肉率、胴體背膘厚、眼肌面積）按A-FABP基因外顯子3基因型分型后進行方差分析，結果（表5）表明，GG基因型胴體重顯著低于CC基因型（P＜0.05）；GG基因型屠宰率極顯著低于GC基因型（P＜0.01），顯著低于CC基因型（P＜0.05）；GG基因型凈肉率顯著低于GC基因型（P＜0.05）；GG基因型眼肌面積顯著低于GC和CC基因型（P＜0.05），GC和CC基因型之間差異不顯著（P＞0.05）。其他性狀在3個基因型間的差異不顯著（P＞0.05）。

表2 A-FABP基因基因型頻率和基因頻率

表3 5個牛類群A-FABP基因外顯子3基因型分布的獨立性檢驗

表4 5個牛類群A-FABP基因外顯子3遺傳多態性分析

對屠宰牛的6個肉質性狀（包括失水率、大理石花紋、肉色、剪切力、蒸煮損失、pH）按A-FABP基因外顯子3基因型分型后進行方差分析，結果（表6）表明，GG基因型失水率顯著高于CC基因型（P＜0.05）；GG基因型剪切力極顯著高于GC和CC基因型（P＜0.01），GC和CC基因型之間差異不顯著；GG基因型蒸煮損失和pH均顯著高于GC基因型（P＜0.05），極顯著高于CC基因型（P＜0.01）。大理石花紋和肉色在3個基因型間的差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 A-FABP基因外顯子3多態性及群體遺傳分析

牛A-FABP基因多態性研究發現秦川牛A-FABP基因第1內含子和第4外顯子上存在突變，而第3外顯子相對保守［9］，也有研究認為秦川牛、南陽牛、魯西牛、夏南牛和郟縣紅牛A-FABP基因5'側翼區、第2和3外顯子及3'側翼區都有變異［17］，在朝鮮牛的2、3、4外顯子也存在突變位點［18］。本研究對5個早勝牛類群A-FABP基因第3外顯子（c.408G＞C）多態性檢測發現，除平涼類群不含CC型外，其他類群3種基因型（GG、GC和CC）都存在，即在AFABP基因編碼區檢測到G/C，與朝鮮牛A-FABP基因第3外顯子上檢測到的突變相同［18］。該研究結果在平涼類群沒有檢測到CC基因型，這種基因型分布的差異可能是由于平涼類群不同于其他4個類群的遺傳特性，CC基因型非優勢基因型，在長期的自然選擇或人工選擇中被淘汰。

經卡方檢驗，西雜牛與平涼類群基因型分布差異顯著（P＜0.05），與慶陽類群、秦雜牛、南雜牛差異極顯著（P＜0.01），這進一步證實了不同群體間遺傳特性的差異，由于群體間遺傳背景本身存在較大的差異，在選育過程中不同等位基因的間接選擇壓力不同，遺傳變異程度不同。多態信息含量（PIC）、有效等位基因數（Ne）和雜合度（He）都是衡量群體內遺傳變異大小的指標，這些數值在大小上均有一致性，多態信息含量大，有效等位基因數和雜合度就相對較大［19］。這3個參數較大時說明群體在該位點的變異性高，有較大的選擇潛力，可以嘗試利用該位點進行標記輔助選擇。遺傳多態性分析結果表明，平涼類群和慶陽類群的PIC分別為0.21、0.24，屬于低度多態（PIC＜0.25）。南雜牛、秦雜牛和西雜牛 PIC分別為 0.37、0.28、0.30、0.37，均處于0.25-0.5之間，屬于中度多態，說明A-FABP基因編碼區G408C位點可以進行標記輔助選擇。χ2適合性檢驗表明，慶陽類群和秦雜牛處于Hardy-Weinberg非平衡狀態，說明該類群自然選擇或者人工選擇對該基因分布的影響較大，造成其分布的不平衡，這可能與育種的個體選擇有關。其他3個類群均處于Hardy-Weinberg平衡狀態狀態，說明這3個類群的牛已經形成了適應各自生存環境的遺傳特性，該突變位點在所在群體內能夠穩定遺傳。

表5 A-FABP基因c.408G＞C位點多態性與胴體性狀的關聯分析

表6 A-FABP基因c.408G＞C位點多態性與肉質性狀的關系

3.2 基因多態性與肉質性狀的關系

A-FABP基因被認為是影響動物肌內脂肪含量的重要候選基因［10］。沉積在肌肉內的脂肪，即肌內脂肪（Intramuscular fat，IMF）含量與肉的嫩度和風味有直接關系［20］。鑒于A-FABP基因對肉質性狀的重要作用，目前國內外展開了該基因在各種牛群體上的研究。王卓［9］對秦川牛A-FABP基因第1內含子和第4外顯子上發現的多態位點進行了分型及其與肉質性狀關聯性分析，發現第1內含子的突變位點與背膘厚、嫩度、大理石花紋等指標存在相關，第4外顯子的GG基因型個體的背膘厚、大理石花紋、嫩度都顯著高于CC基因型。劉艷妍［17］認為5'側翼區的突變對肉牛的產肉性狀影響較大，外顯子2的SNPs與屠宰率、嫩度、胴體長和眼肌面積等相關，外顯子3的SNPs與眼肌面積相關，3'側翼區SNPs與牛胴體深相關。Cho等［13］發現A-FABP基因外顯子2的SNPs與牛背部脂肪厚度相關。Lee等［14］發現，朝鮮牛A-FABP基因外顯子3的一個同義突變位點對牛肉大理石花紋有顯著影響。Barendse等［21］發現，FABP4基因的第3外顯子和第3內含子之間存在一個剪接位點突變，該SNP與澳大利亞牛肌間脂肪沉積顯著相關。

在本研究中，A-FABP基因第3外顯子G408C位點與 Lee等［14］和 Barendse等［21］研究的突變位點一致，但該同義突變位點對大理石花紋的影響未達到顯著水平，這與報道的結果并不一致，可從其他位點研究A-FABP基因SNPs與大理石花紋等級的相關性。本研究的位點突變為同義突變，沒有引起相應氨基酸序列的變化，但由于堿基序列發生了變化，從而影響mRNA本身的翻譯速度，改變蛋白質的表達質量，甚至會導致蛋白質的空間結構發生變化，進而影響其功能的發揮［22］。本研究A-FABP基因SNPs在5個不同早勝牛類群的分布上存在一定差異，并與胴體重、凈肉重、屠宰率、凈肉率、眼肌面積、剪切力、失水率、蒸煮損失和pH等指標有關。本研究A-FABP基因第3外顯子區域SNPs與胴體重、屠宰率、凈肉率、眼肌面積、剪切力、失水率、蒸煮損失和pH等指標的關聯性分析在已查閱的文獻中也未見報道，結果可為后續試驗提供相應的數據參考。對A-FABP基因的遺傳突變位點與試驗牛群體胴體品質和肉質性狀等主要經濟性狀進行關聯分析，所得試驗結果表明A-FABP基因位點SNPs可作為選育和加強胴體和肉質性狀遺傳效應的分子標記。

4 結論

在A-FABP基因外顯子3檢測到一個突變位點，不同基因型間牛的胴體和肉質性狀存在較大差異，可作為對牛胴體品質和肉質性狀選育的遺傳標記。

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