天祝白牦牛IGF-2基因的cDNA克隆

李亞蘭 張全偉 王雪瑩 馬友記 張勇 趙興緒

胰島素樣生長因子（Insulin-like growth factors，IGFs）是生長激素（Growth hormone，GH）發(fā)揮作用的介質(zhì)，主要在肝臟中合成，具有促進有絲分裂、誘導(dǎo)細胞分化、調(diào)節(jié)生長等作用。IGFs包括IGF-1和IGF-2兩種同源多肽，兩個單鏈多態(tài)分子在氨基酸組成上同源性為62％，與胰島素原（Proinsulin）同源性為 50％［1，2］。1976年，Rinderknecht和 Humbel通過將NSILA測序，發(fā)現(xiàn)了不同的生長因子，由于它們在結(jié)構(gòu)上與胰島素非常相似，功能上也有部分相同，所以被正式命名為胰島素樣生長因子1和胰島素樣生長因子2（Insulin like growth factor，IGF-2）［3］。其中，IGF-2也被稱為生長調(diào)節(jié)素 A（Somatomedin A），剛轉(zhuǎn)錄出來的原始IGF-2是由156個氨基酸殘基組成的多肽鏈，經(jīng)過后續(xù)的剪切加工形成成熟的IGF-2，是由67 個氨基酸殘基組成的小分子弱酸性多肽。IGF2分子中包括了胰島素分子內(nèi)所有的半胱氨酸、賴氨酸及大多數(shù)非極性氨基酸，證明它們是由同一個祖蛋白進化而來的［4］。IGF-2能促進細胞的有絲分裂和分化，參與基因組重建，與X染色體的失活有重要關(guān)系［5］。此外，IGF2與個體脂肪沉淀、生長速度等生產(chǎn)性能關(guān)系密切［6，7］，因此可作為影響牦牛肉質(zhì)性狀的候選基因。已有研究表明IGF-2基因有不依賴牦牛骨骼增長而增加體重的作用［8］。目前，國內(nèi)外關(guān)于IGF-2基因及其編碼的蛋白在人及一些動物中已得到深入研究，但迄今尚未有牦牛IGF-2基因cDNA全序列的相關(guān)報道。

天祝白牦牛是分布于天祝縣境內(nèi)海拔3 000 m以上的優(yōu)勢牛種，也是高寒牧區(qū)人民的乳、肉等主要食品及皮毛、骨、角等生活用品的原料，在該地區(qū)具有不可替代的生態(tài)、社會和經(jīng)濟地位。本研究以天祝白牦牛為研究對象，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)獲得cDNA片段，利用cDNA末端快速擴增（RACE）對IGF-2基因進行克隆和分析，旨在為進一步研究IGF-2基因的結(jié)構(gòu)和功能提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

組織樣本選自甘肅省天祝縣成年健康雄性牦牛，屠宰后馬上取其肝臟等臟器組織后放入液氮罐中帶回實驗室，于-80℃超低溫冰箱中保存，備用。

RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Power Taq PCR Master Mix、DNA Marker DL2000、DNA Marker DL500、膠回收試劑盒、pMD-19T載體、菌株E.coliDH5α均購自百泰克生物公司（Bio-Take），3'RACE Kit2nd Generation、5'RACE Kit2nd Generation試劑盒購自于寶生物公司（TaKaRa）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank已發(fā)表的黃 牛（AY957981.1）、 羊（M89788.1）IGF-2基 因mRNA序列，利用Oligo 7設(shè)計天祝白牦牛IGF-2基因CDS區(qū)PCR引物。 根據(jù)RT-PCR獲得的CDS序列，分別設(shè)計5' RACE 和3' RACE的特異引物。引物的相關(guān)信息見表1。

表1 RT-PCR引物序列及參數(shù)

1.2.2 IGF-2基因CDS區(qū)擴增及產(chǎn)物的克隆與測序 根據(jù)RNA提取試劑盒操作說明，提取天祝白牦牛肝臟的總RNA，紫外分光光度計測定總RNA的純度和濃度，0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，-80℃保存。

取2μg總RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，反應(yīng)條件為 48℃，60min；70℃，10min。再以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)總體系為20μL ：cDNA 模板 1μL，上下游引物各 1μL（10μmol/μL），2×Power Taq PCR Master Mix 10μL，ddH2O補足20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min；94℃45s，59℃ 45s，72℃ 1min，30 個循環(huán) ；72℃延伸10min，4℃保存。制作0.8％瓊脂糖檢測PCR產(chǎn)物，對PCR產(chǎn)物進行切膠回收，回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，之后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞，藍白斑篩選挑取陽性克隆，菌落PCR檢測的陽性菌送上海生物工程有限公司測序。

1.2.3 IGF-2基因5'和3'端的序列擴增 以總RNA為模板，按TaKaRa 5'-Full RACE Kit以及3'-FullRACE Kit說明書步驟，擴增天祝白牦牛IGF-2基因5'和3'端的序列，將PCR產(chǎn)物連接載體克隆，菌落PCR檢測的陽性菌送上海生物工程有限公司測序。

1.2.4 IGF-2基因生物學(xué)分析 測序結(jié)果經(jīng)過人工校正后，用DNAMAN軟件進行序列拼接。利用MegAlign（DNASTAR）將天祝白牦牛IGF-2基 因 與 牛（AY957981.1）、 羊（M89788.1）、 豬（HQ450757.1）、馬（ECILGF22）、人（XM005252900.1）、小鼠（NM_010514.3）、大鼠（NM_031511.2）等物種IGF-2 基因氨基酸序列分別進行比對分析，用MAFFT在線軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹［9］。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的提取

總RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測，其紫外吸收值OD260/OD280為1.92；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見28S和18S rRNA各一條帶，亮度比接近2∶1，表明本試驗所提取的天祝白牦牛總RNA的純度和完整性較好，可以用于下一步RT-PCR。

2.2 天祝白牦牛IGF-2基因全長cDNA擴增及克隆測序

以天祝白牦牛肝臟組織為cDNA模板，將PTPCR產(chǎn)物經(jīng)過1％瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增得到了長度為500bp左右的片段，經(jīng)測序確定為544bp。5'RACE 和3'RACE分別獲得510bp和66bp的特異性條帶（圖1），經(jīng)測序?qū)Φ玫降男蛄衅唇樱ト哂嘈蛄校玫教熳０钻笈GF-2 cDNA序列長為1060bp。

圖1 3'RACE（A）和5'RACE（B）擴增產(chǎn)物電泳圖

2.3 天祝白牦牛IGF-2基因cDNA序列分析

獲得的天祝白牦牛IGF-2基因長1060bp，包括111bp的5'UTR，409bp的3'UTR，540bp的開放閱讀框（ORF），起始密碼子ATG位于112 nt，終止密碼子TGA位于649 nt（圖2），該基因已提交至GenBank，獲得登錄號為：KF682139。

2.4 天祝白牦牛IGF-2基因蛋白序列分析

根據(jù)獲得的天祝白牦牛IGF-2基因編碼區(qū)核苷酸序列，推導(dǎo)出編碼179個氨基酸殘基組成的蛋白，該蛋白氨基酸中含量最多的為Ala，占氨基酸總數(shù)的11.2％。經(jīng)ProtParam程序分析天祝白牦牛IGF-2蛋白的分子量為19.7kD，理論等電點（pI）為9.11，不穩(wěn)定系數(shù)為59.56，為不穩(wěn)定蛋白。SMART分析（圖2）表明，該蛋白第1-24位氨基酸為信號肽；第25-91位氨基酸為成熟肽，分為B、C、A、D四個區(qū)域；第112-166位氨基酸為結(jié)構(gòu)域。

2.5 天祝白牦牛IGF-2基因同源性比較

用DNAMAN軟件將天祝白牦牛翻譯后的氨基酸序列分別與GenBank中所報道的羊、黃牛、人、大鼠、小鼠和豬的氨基酸序列進行比對，結(jié)果（圖3）表明，天祝白牦牛IGF-2氨基酸序列與黃牛的同源性最高為94.4％；其次與羊的同源性為91.8％，與豬、人、大鼠和小鼠的同源性分別為85.9％、85.9％、82.3％、80.7％。進化樹（圖4）分析表明，天祝白牦牛IGF-2 基因座位與黃牛和羊的親緣關(guān)系最近。

圖2 天祝白牦牛IGF-2基因cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 天祝白牦牛與其他物種IGF-2氨基酸序列間多序列對位排列

圖4 IGF-2基因與其他物種系統(tǒng)進化樹

3 討論

本研究采用RACE技術(shù)首次成功地克隆得到了天祝白牦牛IGF-2基因編碼區(qū)的全長cDNA，從該基因的核酸序列推斷出IGF-2蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。試驗得到的天祝白牦牛IGF-2基因 cDNA核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列經(jīng)NCBI Blast 序列比對，與已報道的牛、馬、人及小鼠等物種的 IGF-2 基因具有高度的同源性，說明IGF- 2 基因具有高度的保守性。參照人和其他哺乳動物的IGF-2結(jié)構(gòu)，推測所克隆得到的天祝白牦牛IGF-2的氨基酸序列分為信號肽、B、C、A、D和結(jié)構(gòu)域 6個區(qū)域，A 和B 結(jié)構(gòu)域與胰島素原具有極高的同源性，這些結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)對于受體和結(jié)合蛋白識別IGF-2很重要［10］。成熟肽B、C、A、D 4個區(qū)域，共有6個半胱氨酸殘基，可形成3對二硫鍵（33-71，45-84，70-75），對維持IGF-2的空間結(jié)構(gòu)起重要作用。從這些結(jié)果可以看出IGF-2基因在進化上的保守性。IGF-2是目前研究 較多的印跡基因之一，目前，IGF-2已在人、鼠、羊、豬和牛等物種被確定為印記基因，且正常情況下大多數(shù)組織均為母源印記［11，12］，即父源等位基因表達。IGF-2基因在其他哺乳動物中是否存在基因印跡現(xiàn)象，是否也是父源等位基因基因，都有待于進一步的研究。

近年來，家畜經(jīng)濟價值的研究受到廣泛關(guān)注，牦牛作為一種重要的經(jīng)濟物種，其肉、毛 奶等具有較高的經(jīng)濟價值［13］。由于牦牛生存環(huán)境受到多種因素（低氧、寒冷、放牧周期短等）的影響［14-16］，其生長可能被抑制。IGF-2作為牦牛肉質(zhì)研究的候選基因，其結(jié)構(gòu)和功能的研究具有重要的意義。IGF-2是一種多功能細胞增殖調(diào)控因子，在細胞的分化，增殖、胚胎的生長發(fā)育以及腫瘤細胞增殖中具有重要的促進作用［17］，通過促進牦牛骨骼發(fā)育和肌肉增長，從而增加其產(chǎn)肉量，達到提高其經(jīng)濟價值的效果［14］。本研究對IGF-2結(jié)構(gòu)研究及其功能的預(yù)測，為進一步對IGF-2功能研究奠定基礎(chǔ)，為牦牛經(jīng)濟價值開發(fā)提供參考和理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究運用同源序列克隆技術(shù)結(jié)合RACE技術(shù)，獲得全長1060bp天祝白牦牛IGF-2基因的cDNA，并對其氨基酸與編碼氨基酸序列特性進行了研究。該基因的成功克隆為進一步研究牦牛IGF-2基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

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