白藜蘆醇對C3H10T1/2間質干細胞成骨分化及CXCL12、EGFR和CCL2基因表達的影響

左長清+鐘月春+汪宗桂+戴忠+吳鐵

[摘要] 目的 探討白藜蘆醇對C3H10T1/2細胞成骨分化的作用及CXCL12、EGFR和CCL2基因表達的影響。 方法 采用CCK-8法檢測不同濃度白藜蘆醇對C3H10T1/2細胞增殖影響，堿性磷酸酶染色鑒定早期成骨分化，實時熒光定量PCR法檢測CXCL12、EGFR和CCL2基因的表達。 結果 白藜蘆醇在20 μmol/L濃度對C3H10T1/2細胞增殖沒有影響（P > 0.05），隨著濃度增加，40、80、100 μmol/L的白藜蘆醇明顯抑制細胞增殖（P < 0.05）。20 μmol/L白藜蘆醇能增強重組人骨形成蛋白2（rhBMP-2）誘導C3H10T1/2的堿性磷酸酶染色。白藜蘆醇對C3H10T1/2細胞CXCL12、EGFR、CCL2基因表達沒有明顯影響（P > 0.05）。 結論 白藜蘆醇能促進rhBMP-2誘導成骨分化。促成骨分化作用可能不是通過調控CXCL12、EGFR和CCL2基因的表達來實現。

[關鍵詞] 早期成骨分化；間質干細胞；基因表達；白藜蘆醇

[中圖分類號] R285；R966 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）08（c）-0009-04

Effects of resveratrol on early osteoblast differentiation and CXCL12， EGFR and CCL2 gene expression of C3H10T1/2 mesenchymal stem cell

ZUO Changqing1 ZHONG Yuechun1 WANG Zonggui2 DAI Zhong1 WU Tie1

1.Department of Pharmocology， Guangdong Medical College， Guangdong Province， Dongguan 523808， China； 2.Department of Biochemistry， Guangdong Medical College， Guangdong Province， Dongguan 523808， China

[Abstract] Objective To study the effects of resveratrol on early osteoblast differentiation and mRNA expression of CXCL12， EGFR and CCL2 of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells. Methods The C3H10T1/2 cell proliferation was detected using CCK-8 after different concentrations of resveratrol. The early osteoblast differentiation was identified by alkaline phosphatase （ALP） staining. The mRNA expression of CXCL12， EGFR and CCL2 was detected using real time quantitative RT-PCR. Results The resveratrol less than 20 μmol/L concentrations had no effect on C3H10T1/2 cell proliferation （P > 0.05）， however， high concentrations of resveratrol （40， 80， 100 μmol/L） inhibited the C3H10T1/2 cell proliferation （P < 0.05）. 20 μmol/L resveratrol enhanced rhBMP-2-induced ALP staining of C3H10T1/2 cell， but the gene expressions of CXCL12， EGFR and CCL2 were not changed （P > 0.05）. Conclusion Resveratrol can promote the rhBMP-2-induced osteogenic differentiation， but which may not act through regulating the mRNA expression of Cxcl12， Egfr and Ccl2.

[Key words] Early osteoblastic differentiation； Mesenchymal stem cells； Gene expression； Resveratrol

骨質疏松癥是世界范圍內的常見病、多發病。促進間質干細胞成骨定向分化與成熟是治療骨質疏松癥的新的有效手段。白藜蘆醇是一種含有芪類結構非黃酮類多酚化合物，具有促進間質干細胞向成骨細胞方向分化，并抑制間質干細胞向脂肪細胞分化潛能[1]，但白藜蘆醇促成骨分化機制尚未完全闡明。

間質干細胞成骨分化是一個非常復雜的生物過程[2]，涉及到多基因、多信號通路組成的復雜基因調控網絡。筆者前期通過網絡生物學方法研究發現CXCL12、EGFR和CCL2基因在重組人骨形成蛋白2（rhBMP-2）成骨分化網絡中處于中心節點[3]。本文應用C3H10T1/2間質干細胞培養體系，觀察白藜蘆醇對rhBMP-2促成骨分化作用及對CXCL12、EGFR和CCL2基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠間質干細胞C3H10T1/2購自中國科學院上海細胞庫。白藜蘆醇（Sigma），rhBMP-2（Human Zyme），napthol AS-MX phosphate和Fast Blue BB salt（Sigma），TRIzol（Invitrogen），RT-PCR Kit（TaKaRa），CCK-8（Dojindo）。

1.2 實驗方法

1.2.1 CCK-8法檢測藥物對細胞增殖功能的影響 C3H10T1/2細胞生長至80%融合，用含0.25%胰酶的消化液消化，制成細胞懸液，以3000個細胞/孔接種于96孔板內，37℃ 5%CO2培養箱中培養。24 h細胞貼壁后，更換含不同濃度白藜蘆醇（分別為0、5、10、20、40、80、100 μmol/L）的DMEM培養液100 μL，細胞繼續培養48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養箱中孵育2 h，以多功能酶標儀讀取波長450 nm處的OD值。按下述公式計算細胞的生長抑制率：細胞生長抑制率（%）=（1-用藥組平均吸光度/對照組平均吸光度）×100% 。

1.2.2 堿性磷酸酶染色鑒定成骨分化 C3H10T1/2接種于24孔板中，細胞生長至約90%融合，實驗分為三組：空白對照組、300 ng/mL rhBMP-2組、20 μmol/L白藜蘆醇+ 300 ng/mL rhBMP-2組，每3天更換1次培養基。當成骨誘導分化6 d后，單層細胞用PBS清洗2次，然后用體積分數為0.70乙醇室溫固定15 min，采用含0.1 mg/mL napthol AS-MX phosphate和 0.6 mg/mL Fast Blue BB salt染色液避光染色30 min，用蒸餾水漂洗細胞3次，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.3 實時熒光定量PCR法檢測CXCL12、EGFR和CCLl2 mRNA的表達 C3H10T1/2細胞接種至12孔細胞培養板，20 μmol/L白藜蘆醇處理48 h后，Trizol法提取細胞總RNA，經PrimeScriptTM RT reagent Kit逆轉錄反應制備cDNA，real time PCR檢測CXCL12、EGFR和CCL2 mRNA的表達，采用GAPDH基因作為內參照，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt表示基因相對表達水平。

表1 定量RT-PCR引物序列

1.3 統計學方法

應用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對細胞生長的影響

白藜蘆醇在低劑量組（5、10、20 μmol/L）對C3H10T1/2間質干細胞生長沒有明顯影響，既不能促進細胞生長，同時對細胞生長也沒有明顯的抑制作用，隨著劑量增大至40 μmol/L時，白藜蘆醇對細胞產生明顯的生長抑制作用，當劑量達到80～100 μmol/L時，生長抑制率達到84%。表明高劑量的白藜蘆醇具有明顯的細胞毒性。因此，后續實驗采用20 μmol/L白藜蘆醇。見表2。

表2 不同濃度白藜蘆醇對C3H10T1/2間質干細胞增殖的影響

（x±s，n = 4）

注：與0 μmol/L比較，**P < 0.05；“-”表示基本無抑制，未計算該數據

2.2 白藜蘆醇對rhBMP-2促成骨分化影響

C3H10T1/2間質干細胞經成骨誘導分化6 d堿性磷酸酶染色顯示：空白對照組細胞未見藍紫色；300 ng/mL rhBMP-2組細胞呈藍紫色，提示rhBMP-2能誘導間質干細胞早期成骨定向分化；而300 ng/mL rhBMP-2+20 μmol/L白藜蘆醇組ALP陽性細胞數明顯增多，且ALP顏色增深。表明非毒性劑量下，20 μmol/L白藜蘆醇能增強rhBMP-2促成骨分化作用。見圖1。

A：空白對照組；B：300 ng/mL rhBMP-2組；C：300 ng/mL rhBMP-2+ 20 μmol/L白藜蘆醇組

圖1 C3H10T1/2間質干細胞成骨誘導6 d堿性磷酸酶染色

2.3 白藜蘆醇對CXCL12、EGFR和CCL2 mRNA表達的影響

前期筆者通過網絡生物學對rhBMP-2誘導C3H10T1/2成骨分化基因表達譜進行分析，結果發現，CXCL12、EGFR和CCL2基因在rhBMP-2成骨分化網絡中處于中心節點。為了鑒定白藜蘆醇促成骨分化作用是否通過影響rhBMP-2成骨分化網絡，本研究用20 μmol/L白藜蘆醇處理C3H10T1/2細胞48 h后，觀察上述基因表達水平。結果表明：白藜蘆醇處理組CXCL12、EGFR和CCL2表達水平分別為（1.02±0.09）、（1.03±0.05）、（1.10±0.11），與對照組相比，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖2。

3 討論

rhBMP-2是一種被FDA批準的重要促成骨藥物，目前已在臨床尤其是整形外科領域廣泛使用[4]。眾多研究表明，rhBMP-2具有非常明顯的促進間質干細胞、前體成骨細胞骨向分化作用[5-7]。本研究采用300 ng/mL rhBMP-2作用C3H10T1/2間質干細胞6 d，ALP染色表明，rhBMP-2能誘導C3H10T1/2間質干細胞早期成骨分化，與前述研究結果一致。

系統生物網絡揭示：復雜疾病不能通過干預單一靶點而奏效，必須通過干擾疾病生物網絡多個關鍵節點。研究藥物干擾疾病網絡，形成了藥理學一個新興的分支——網絡藥理學或網絡生物學[8-9]。前期筆者通過網絡生物學方法對rhBMP-2誘導C3H10T1/2成骨分化基因表達譜進行分析，結果發現，CXCL12、EGFR和CCL2基因在rhBMP-2成骨分化網絡中處于中心節點。目前已經證明EGFR信號參與骨原始細胞群維持、成骨分化平衡調控[10]，同時與前體成骨細胞活性和增殖[11]相關。而CXCL12信號參與骨形成和骨吸收調控[12]。最近表明BMP-9誘導間質干細胞成骨分化早期和中期，CXCL12信號軸發揮重要作用[13]。

綜觀目前國內外研究進展，關于白藜蘆醇促成骨作用機制主要涉及到ERK1/2信號通路[14]、WNT信號通路[15]，同時通過激活Sirt1/Runx2[16]或者抑制PPAR2活性，從而抑制干細胞成脂分化，促進成骨分化[1]。但是，間質干細胞成骨分化涉及到多基因、多信號通路組成的復雜基因調控網絡，白藜蘆醇在整個成骨分化復雜生物網絡中起到怎樣的調控作用，目前知之甚少。本研究采用20 μmol/L白藜蘆醇聯合rhBMP-2作用C3H10T1/2細胞，結果表明白藜蘆醇具有促進rhBMP-2的成骨誘導作用。進一步分析白藜蘆醇對rhBMP-2成骨分化網絡中心節點CXCL12、EGFR和CCL2的影響，結果表明白藜蘆醇對上述基因表達沒有明顯的作用。這說明白藜蘆醇促成骨分化作用可能不是通過調控CXCL12、EGFR和CCL2網絡接點來實現。分析原因可能是：①在BMP-2成骨分化網絡中，存在其他重要節點，白藜蘆醇可能通過影響其他網絡節點發揮作用；②筆者僅僅分析了rhBMP-2促成骨蛋白互作網絡，對于rhBMP-2更加復雜的轉錄調控網絡，由于需要更多時間點基因芯片數據，沒有進行分析；③成骨分化是一個動態的時續過程，網絡節點也會根據分化程度發生部分時續改變。

綜上，本研究證明低劑量白藜蘆醇能增強rhBMP-2成骨分化作用，在臨床上，可以聯合應用增強療效，同時對白藜蘆醇作用進行了初步網絡分析。隨著研究深入，芯片數據量的增加，技術成熟，可以進一步對轉錄調控網絡、時續動態網絡進行分析，從而進一步解析白藜蘆醇促成骨分化機制。

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（收稿日期：2014-05-11 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2014-05-11 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2014-05-11 本文編輯：程 銘）