多維指紋圖譜在中藥質量評價中的應用

曹 玲 劉莉莉 王連芝 付 蕾

黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江哈爾濱 150040

中藥指紋圖譜是指中藥材、提取物或中藥制劑等經適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示該中藥材、提取物或中藥制劑特性的共有峰的圖譜。從1984年香港中文大學中藥研究中心提出了開展中藥成分 “指紋”鑒定工作的設想以來，我國就開始了指紋圖譜的研究[1]。國家藥品監督管理局于2000年頒布了《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》[2]，要求中規定，為確保中藥注射劑質量穩定、可控，中藥注射劑在固定了中藥材品種、產地和采收期的前提下，需要制訂中藥材、有效部位或中間體、注射劑的指紋圖譜。特別是在《中國藥典》（2010年）中，建立了能反映中藥整體特性的色譜指紋圖譜方法（如滿山紅油、薄荷素油、積雪草總苷、莪術油、丹參酮提取物、丹參總酚酸提取物、三七總皂苷和三七三醇皂苷等藥材及其提取物）。指紋圖譜技術在我國中藥質控方面得到了迅速發展。

2000年羅國安等[3]提出了多維指紋圖譜的概念。多維指紋圖譜，即采用多種分析儀器聯用的模式來建立指紋圖譜（如 HPLC-DAD-MS、HPLC-MS-MS、GC-MS、CE-MS[4]）。多維指紋圖譜的優點是在色譜分離的同時還能進行光譜的在線檢測，從而產生的數據既包括色譜的化學信息又包括光譜的信息。因此，這一方法特別適合中藥及其制劑這一復雜體系的測定。

建立多維指紋圖譜的組合方式主要包括：不同柱子的串并聯、不同檢測器的串并聯、不同色譜方法的組合及不同儀器間的組合。建立多維指紋圖譜的一些常見聯用技術主要有高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）、高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器-質譜（HPLCDAD-MS）、高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器-蒸發光散射檢測器（HPLC-DAD-ELSD）、高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器-核磁（HPLC-DAD-NMR）、毛細管電泳-質譜（CE-MS）、氣相色譜-質譜（GC-MS）等。

1 HPLC-DAD

高效液相色譜儀的DAD檢測到的圖譜是三維譜圖，用DAD建立指紋圖譜，得到的圖譜就是最簡單的多維指紋圖譜。DAD的光柵在流通池后，用陣列二極管同時測定各個波長的光強度，因此在每一個色譜時間點上都可以同時得到紫外光譜圖，而且得到的光譜圖會隨著色譜保留時間方向上的化學成分和濃度的不同而發生變化。測得的數據中既包含色譜信息也包含光譜信息。色譜的保留時間結合光譜信息可以用來進行定性鑒定，而色譜的峰高與峰面積等可以用來進行定量檢測[5]。

謝顯珍等[6]利用HPLC-DAD建立了黃芪藥材中黃酮類化合物的色譜指紋圖譜。在利用聯用色譜提供的色譜以及光譜信息的基礎上，利用一些化學計量學方法獲取了主要黃酮類物質的光譜圖，將這些光譜圖與標準圖譜相對照，以定性指紋圖譜中主要的黃酮類組分，進而表征和建立了不同產地黃芪藥材中黃酮類化合物特征色譜指紋圖譜。此外，胡建蘭等[7]利用HPLC-DAD建立了涼膈散湯劑的指紋圖譜，建立了該方湯劑整體特征的質量評價方法。侯志飛等[8]利用HPLC-DAD建立了梔子及其炮制品指紋圖譜，應用在線紫外光譜對指紋峰進行了定性歸屬研究。胡虒堯等[9]建立了當歸芍藥散的HPLC-DAD指紋圖譜，根據HPLC圖中各峰的保留時間和DAD檢測的紫外光譜圖的進行比對，認定了峰的來源，對方中部分特征峰進行了歸屬。袁曉等[10]建立了茜草HPLC-DAD指紋圖譜，提供了茜草藥材的質量控制方法。

2 HPLC-DAD-MS

質譜檢測器（MSD）在選擇性、通用性、靈敏度和化合物的分子量及結構信息的提供等方面均有較突出的優點。HPLC-DAD-MS聯用技術實現了在分離成分時，能夠在線提供各指標性成分或活性成分化學結構信息，能夠提供深層次分析信息的工具，而且檢測的高靈敏度可以解決一些藥材近緣品種指紋圖譜中雖然有指紋特征，但信號微弱，又有必要辨認組分的分析[11]。

早在2001年，戴德舜等[12]及曹進等[13]就利用HPLCDVD-MS-MS技術對桂枝湯A部分雙向調節樣品及單向升溫樣品進行指紋圖譜的確定。該實驗分析了MS總離子流圖及高效液相譜圖主峰對應的可能分子量，根據藥典和桂枝湯中五種單味藥有效成分的相關資料，推測出了桂枝湯A部分雙向調節作用的物質基礎可能對應單味藥的物質來源。并且利用LC-MS聯用技術對桂枝湯A部分以及組成桂枝湯五味單味藥A部分進行多維全息化學特征譜的指認。通過Mass的質荷比（M/Z）值及HPLC色譜峰的保留時間相互對照，將桂枝湯A部分中主要成分進行歸屬，為進一步研究藥效作用的走向提供了有效途徑。聶晶等[14]采用HPLC-UVD對生血寧片的指紋圖譜進行了研究，并利用UPLC/DAD/Q-TOF-MS技術對其中主要色譜峰進行了歸屬，為更好地控制生血寧片質量提供可靠依據。

3 HPLC-DAD-ELSD

蒸發光散射檢測器（ELSD）的工作原理是，色譜柱流出物經過蒸發器將流動相蒸發，待測成分變成微粒氣霧流，一定強度的光照射此微粒，測定其散射光，散射光的強度取決于測定的微粒的大小和多少，而與其結構關系不大。因此，對于沒有紫外吸收的皂苷類等化合物來說，用ELSD特別適合。DAD可檢測出有共軛體系的化合物的特征吸收，ELSD可檢測皂苷類化合物等紫外吸收不明顯的化合物的吸收信息。應用二極管陣列檢測-蒸發光散射檢測聯用測定中藥材及其制劑可有效的互補。

閆艷等[15]建立了酸棗仁藥材HPLC-DAD-ELSD指紋圖譜。現代藥理研究表明，酸棗仁中鎮靜催眠的主要有效成分是皂苷類和黃酮類。皂苷類成分大多沒有明顯的紫外吸收，用紫外檢測器測定效果不好，基線漂移嚴重，相應值低。應用ELSD測定皂苷類成分效果好，基線穩定，有很好的響應值。因此，采用HPLC-DAD-ELSD法既能測定酸棗仁藥材中的黃酮類成分，又能測定皂苷類成分，一次進樣可同時測得兩類成分的指紋圖譜，從而使得對酸棗仁的質量評價更加全面。此外，蘇碧茹等[16]采用HPLC-DAD-ELSD串聯技術建立了黃芪藥材的HPLC-DAD-ELSD色譜指紋圖譜，為黃芪藥材的全面質量控制提供了科學依據。石媛慧等[17]采用DAD串聯ELSD建立不同品種石斛的HPLCDAD-ELSD指紋圖譜，可直接反映石斛品種與化學成分變化的關系。

4 HPLC-DAD-NMR

核磁共振波譜法（NMR）是將自旋核放入磁場，用適宜頻率電磁波照射它們，其吸收能量，發生原子核能級躍遷，同時會產生核磁共振信號，從而得到核磁共振譜。核磁共振譜能夠提供的參數主要有化學位移、質子的裂分峰數、偶合常數及各組峰的積分高度等。而這些參數與有機化合物的結構有著非常密切的關系。故此，核磁共振譜是鑒定有機化合物、金屬有機化合物及生物分子結構和構象等的重要工具之一。NMR作為一種波譜型指紋圖譜與HPLC這一色譜型指紋圖譜相結合，在中藥材及中藥復方這一復雜體系中將所有成分的信息盡可能多的表現出來，具全面性和整體性的優勢。

林云良等[18]建立了金銀花的HPLC-DAD-NMR指紋圖譜。采用高效液相色譜法及核磁共振的方法，對山東產金銀花的乙醇提取物中的活性成分進行了系統的研究，建立了其指紋圖譜。此兩種方法聯用作為檢測手段能夠很好地表征中藥材及其制劑的內在化學成分特征及其相對之間含量差異。

5 CE-MS

毛細管電泳法（CE）是指帶電質點（膠粒或離子）在電解質溶液中在電場的作用下，向荷電相反電極遷移的現象稱為電泳。因為帶電質點的電荷數量、電荷符號和質點大小的差別，遷移速度有所不同，從而分離。電泳若是在毛細管中進行的則為毛細管電泳法。毛細管電泳法不僅能分離分析有機化合物，無機陰、陽離子，手性分子，中性分子和大分子，而且具有柱效高、樣品用量少、分析速度快、應用范圍廣等特點。CE指紋圖譜具有很好的專屬性，當與高靈敏度的質譜檢測器聯用時，能夠得到較低的檢測限。此外，質譜還可以提供分子量用于定性，多級質譜還可以提供結構的碎片信息，而用于結構鑒定。因此，毛細管電泳質譜聯用技術用于中藥的研究，應用前景比較廣闊。孫毓慶等[19]系統總結了毛細管電泳指紋圖譜以及毛細管電泳-質譜聯用技術在中藥質量控制中的作用。

6 GC-MS

氣相色譜法（GC）是以氣體為流動相的色譜分離技術。在中藥質量現代化的研究過程中，氣相色譜法有較為重要的地位。對于含有揮發性成分、主要成分為脂肪酸類的中藥材及揮發油等成分的質量控制有著不可替代的作用和比較理想的分離效果。氣相色譜法和質譜聯用具有比較好的定性功能，使中藥材及其制劑指紋圖譜的研究更加系統和完整，并且為解決中藥研究中缺乏標準品提供了可行之路。

華永麗等[20]建立了當歸及其炮制品揮發油的GC-MS化學指紋圖譜。以當歸及其不同炮制品為樣品，以氣相色譜-質譜聯用技術為分析方法，運用統計分析手段，建立了從化學指紋圖譜中發現不同炮制品潛在標志物的方法。耿放等[21]建立了桂枝茯苓丸脂溶性成分GC-MS指紋圖譜，從整體定性方面評價桂枝茯苓丸的質量優劣。潘瑞景等[22]對不同產地半枝蓮藥材及其混淆品的GC-MS指紋圖譜進行研究，證明了九個不同產地半枝蓮具有統一性，與混淆品之間具有明顯的差異。

7 不同儀器的組合

用不同儀器建立指紋圖譜，這些儀器在技術上及在原理上能夠優勢互補，能夠合理交叉地整合定性信息，為綜合鑒定中藥質量的全貌奠定基礎，這為尋找中藥大復方體系的標準制劑提供一種探索模式，且具有現實性、有效性、可靠性和可操作性。

孫國祥等[23-24]建立了防風通圣丸及柏子養心丸的高效液相色譜指紋圖譜、紫外光譜指紋圖譜、紅外光譜指紋圖譜及熱值譜，形成多元多維方法交叉評價防風通圣丸質量的方法。用190～400 nm的紫外區間紫外光譜指紋圖譜表達π→π*，n→π* 和 n→σ* 的化學組分，用 4000～400 cm-1紅外光譜指紋圖譜表達單鍵、雙鍵及三鍵等的振動（或轉動）對中紅外線的吸收，這些均以光譜點為評價單元。用燃燒焓衡量中藥的有機物達到高價氧化態的熱釋放度，以此來揭示有機組分的總量。故以此四種多元多維指紋圖譜的交叉整合能夠監測中藥各類化學成分分布的情況，為中藥的質量控制提供了一種簡單探索性的方法。此外，陳新新等[25]建立了六味地黃丸（濃縮丸）的五波長高效液相色譜指紋圖譜、紫外指紋圖譜和導數指紋圖譜，為其藥效物質均一性的評價提供了一種有效的方法。孫國祥等[26]建立了維C銀翹片紫外指紋圖譜、紅外指紋圖譜及測定燃燒熱，利用兩種光譜指紋圖譜實現對中藥全化學成分的（雙鍵、三鍵和飽和鍵）全面監測。

總之，中藥及其制劑化學成分非常復雜，用單一指紋圖譜不能兼顧所有化學成分。多維指紋圖譜實現了分析方法多元化和檢測方式的多維化，能夠獲得中藥的立體空間指紋圖譜。多維指紋圖譜實現了分析方法多元化和檢測方式的多維化，從而能夠獲得中藥的立體空間指紋圖譜。由于多元多維指紋圖譜技術從多元的分析方法和多維的檢測方式來獲得中藥化學組分的全信息而形成立體多息譜，因此，只有對其進行合理的整合和有效的數據挖掘才能夠從多側面、整體方位詳細描述及準確表征中藥中全部組分的含量分布狀況[23]。故此，多維指紋圖譜目前面臨的難題是如何快速找到適合的評價分析方法，從而建立科學的評價體系，能夠解釋和評價中藥中包含的藥效成分信息，能夠把數據的應用從低層次的簡單查詢，提升到在數據中挖掘知識，獲取數據背后潛在的、有用的信息，以此來描述中藥多維指紋圖譜的整體特征，對于現階段而言，亟需解決的問題是將各種聯用方式、各種儀器得到的數據進行合理的整合，從而達到全面控制中藥及其制劑的質量。希望能夠建立切實有效的中藥指紋圖譜，為中藥質量控制服務，使對中藥及其制劑的質量評價更加全面準確。多維指紋圖譜的出現即是為了更加全面地反映中藥各類成分的全貌，因此，中藥指紋圖譜的發展必將是多儀器、多測定方式的聯用的多維指紋圖譜。

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