浙貝乙素與浙貝乙素膽酸酯對人細胞色素P450酶活性的影響

吳瀟，彭瑛，張鵬，吳繼洲

[1.天津市中藥質量控制(企業)重點實驗室，天津中新藥業研究中心，天津 300457;2.中國藥科大學藥物代謝動力學重點實驗室，南京 210009;3.湖北省天然藥物與資源評價重點實驗室，華中科技大學同濟醫學院藥學院，武漢 430030]

湖北貝母為百合科貝母屬植物湖北貝母(Fritillaria hupehensis Hsiao et K.C.Hsia)的干燥鱗莖，被《中華人民共和國藥典》2010年版收載，具有鎮咳、平喘、祛痰的功效[1]。系統研究表明，總生物堿為其活性部位[2-3]。其中主要單體成分浙貝乙素具有良好的鎮咳、祛痰活性[4-5]，具有進一步開發的潛能。蛇膽川貝散為一經典中藥復方，臨床療效顯著，毒副作用小。現代藥理學研究表明，生物堿和膽汁酸為其主要有效成分。本課題組借助結構拼合的思路，合成了浙貝乙素與膽汁酸的系列酯化合物，經藥效學篩選，浙貝乙素膽酸酯的鎮咳、祛痰活性最強，且毒性遠低于浙貝乙素[5-6]。

代謝性藥物相互作用占藥動學相互作用的40%，從1995年到現在，由代謝性藥物相互作用引起藥理或毒理效應變化的臨床案例報道增加了10倍以上[7]。因此，在活性化合物開發的早期進行代謝性相互作用的研究具有重要意義。筆者在本研究中采用體外混合探針底物法，對浙貝乙素和浙貝乙素膽酸酯對5種主要的人細胞色素P450(cytochrome P450，CYP)酶亞型的抑制作用進行評價，以期為浙貝乙素及其衍生物的進一步開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試藥 浙貝乙素(純度＞98%)、浙貝乙素膽酸酯(純度＞98%)由華中科技大學同濟醫學院藥學院吳繼洲教授提供;奧美拉唑鈉鹽(批號:100367-201104)、氫溴酸右美沙芬(批號:100201-199901)、馬來酸咪達唑侖(批號:171250-200401)、左氧氟沙星(批號:130455-201117，純度:98%)購自中國食品藥品檢定研究院;甲苯磺丁脲(批號:017K1025)、睪酮(批號:564026)購自Fluka公司;非那西丁(批號:016K1602)、對乙酰氨基酚(批 號:099K0126V)、4-羥 基 甲 苯 磺 丁 脲 (批 號:0001407794)、5-羥基奧美拉唑(批號:1194-013A3)、右啡烷(批號:BCBF7621V)、1-羥基咪達唑侖(批號:065K3262)、6β-羥基睪酮(批號:306461)購自 Sigma 公司;十二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4· 2H2O)、氯化鉀(KCl)、六水氯化鎂(MgCl2·6H2O)購自南京化學試劑廠;甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)購自Sigma公司;其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀器 美國熱電公司Finnigan高效液相色譜-四極桿串聯質譜聯用儀(含Finnigan Surveyor高效液相色譜系統、Finnigan TSQ Quantum Discovery max質譜系統、電噴霧離子源、Xcalibur1.2工作站及LCQuan數據處理軟件);色譜柱 Phenomenox Luna C18柱(2.0 mm ×150 mm，5 μm);Vortex-Genie 2 渦旋混合器;Eppendorf高速冷凍離心機;Milli-Q Gradient A1超純水機。

1.3 人肝微粒體 混合人肝微粒體(human liver microsomes，HLMS)購自瑞德肝臟疾病研究(上海)有限公司，由 10名捐獻者的肝臟制得，其 CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4 活性由瑞德肝臟疾病研究(上海)有限公司鑒定，微粒體蛋白濃度為10 mg ·(500 μL)－1。

1.4 肝微粒體體外孵育 溫孵反應體系包括人肝微粒體(0.2 mg·mL－1)，氯化鎂(MgCl2，10 mmol·L－1)，磷酸鹽 緩 沖 液 (Na2HPO40.1mol· L－1，NaH2PO40.1 mol·L－1，KCl 0.1 mol·L－1，pH=7.4)，混合探針底物(CYP1A2/非那西丁/70 μmol·L－1，CYP2C9/甲苯磺丁脲/4 2.7 μmol·L－1，CYP2C19/奧美拉唑/22.6 μmol·L－1，CYP2D6/右美沙芬/4.05 μmol·L－1，CYP3A4/咪達唑侖/3.53 μmol·L－1，CYP3A4/睪酮/53.3 μmol·L－1)，以及受試化合物，反應體系中有機溶劑的含量≤1%。將反應體系在37℃恒溫水浴中預熱5 min后，加入NADPH能量系統(其組成為:NADP/0.5 mmol·L－1，G-6-P/10 mmol·L－1，G-6-P-DH/1 U·mL－1)啟動反應，溫孵20 min后，0℃冰浴快速終止反應。

實驗分為空白對照組、浙貝乙素組和浙貝乙素膽酸酯組，空白對照組以溶劑甲醇代替試藥，浙貝乙素和浙貝乙素膽酸酯在溫孵反應體系中的系列終濃度均為0.4，2，8，40，200 μmol·L－1。各溫孵反應平行做3 份。

1.5 樣品處理與色譜分析 在溫孵體系中加入含內標(左氧氟沙星，200 ng·mL－1)的甲醇溶液(1∶1)沉淀蛋白，振蕩3 min，20 000 r·min－1離心10 min 后，取上清液進樣，分析其中6種探針底物特征代謝物的濃度。色譜條件:Phenomenox Luna C18柱(2.0 mm ×150 mm，5 μm)，流 動 相 為:(A)含 1‰ 甲 酸 的0.5 mmol·L－1醋酸銨緩沖液，(B)甲醇，梯度洗脫，0 ～2.0 min，5% ～50%B;2.0 ～6.0 min，50% ～60%B;6.0 ～7.0 min，60%B;7.0 ～7.5 min，60% ～5%B;7.5 ～ 12.0 min，5%B，流速為 200 μL·min－1，柱溫40℃。質譜條件:ESI離子源:電噴霧電壓 4 400 V(+)，加熱毛細管溫度 350℃，鞘氣(N2)流速7.5 L·min－1(30 Arb)，輔助氣(N2)流速10 L·min－1(10 Arb)，碰撞氣(Ar)壓力0.2 Pa(1.5 mTorr)。正離子模式下同時掃描各代謝產物和內標的母離子及產物離子，選擇豐度最大的碎片離子進行多級反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)，各化合物的 MRM參數見表1。

1.6 IC50值的計算 受試化合物任一濃度水平下所測任一亞型代謝產物的生成量與相應溶劑空白對照組中該代謝產物的生成量之比即為該化合物水平下所測亞酶活性的相對剩余活力百分數，以其為縱坐標(Y)，受試化合物的對數(Log10)摩爾濃度為橫坐標(X)，借助軟件GraphPad Prism 4.0 demo擬合即可得到受試化合物對任一CYP亞型的半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)抑制效應圖。

表1 各化合物母離子和碎片離子MRM參數Tab.1 MRM parameter of parent ion and fragment ion of each compound

2 結果

2.1 各代謝產物的標準曲線 在滅活的人肝微粒體溫孵體系中，加入系列濃度的混合探針代謝產物(0.066/0.014/0.0055/0.0058/0.0058/0.049，0.013/0.035/0.014/0.012/0.015/0.098，0.33/0.070/0.028/0.023/0.029/0.16，0.66/0.17/0.055/0.039/0.058/0.33，1.32/0.35/0.14/0.078/0.15/0.82，3.29/0.7/0.28/0.19/0.29/1.64，6.58/1.74/0.55/0.39/0.73/3.28，13.16/3.48/1.38/0.78/1.46/8.20，25.00/6.97/2.76/1.94/2.63/16.39 μmol·L－1，對乙酰氨基酚/4-羥基甲苯磺丁脲/5-羥基奧美拉唑/右啡烷/1-羥基咪達唑侖/6β-羥基睪酮)，按照“樣品處理與色譜分析”項處理分析。各特異性探針底物的線性回歸方程和線性范圍分別為:對乙酰氨基酚/CYP1A2:Y=0.136 1X － 0.003(R2=0.995 7，0.066 ～25.00 μmol·L－1);4-羥基甲苯磺丁脲/CYP2C9:Y=0.248 6X+0.001 5(R2=1.000 0，0.014 ～6.97 μmol·L－1);5-羥 基 奧 美 拉 唑/CYP2C19:Y=0.639 3X+0.002 3(R2=0.999 8，0.005 5 ～2.76 μmol·L－1);右啡烷/CYP2D6:Y=0.121 9X －0.004 7(R2=0.991 0，0.066 ～ 16.39 μmol·L－1);1-羥基咪達唑侖/CYP3A4:Y=2.466 3X －0.007 9(R2=0.999 0，0.005 8 ～ 2.63 μmol·L－1);6β-羥基睪酮/CYP3A4:Y=0.121 9X －0.004 7(R2=0.991 0，0.049～16.39 μmol·L－1)。

2.2 浙貝乙素、浙貝乙素膽酸酯對人肝微粒體CYP酶活性的影響 浙貝乙素、浙貝乙素膽酸酯對人肝微粒體5種主要CYP酶亞型活性的影響分別見圖1，圖2。結果表明，浙貝乙素在 0 ～200 μmol·L－1范圍內對CYP2C9亞型基本沒有抑制效應，對 CYP1A2，CYP2D6，CYP2C19，CYP3A4四種亞型有很弱的抑制效應，抑制率≤50%。浙貝乙素膽酸酯在0～200 μmol·L－1范圍內對 CYP1A2 亞型有較強的抑制作用，IC50約為 128 μmol·L－1;對 CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP3A4四種亞型有很強的抑制作用，IC50分別約為 4(CYP2C9)，8(CYP2C19)，5(CYP2D6)，3(CYP3A4，睪酮為底物)，11 μmol·L－1(CYP3A4，咪達唑侖為底物)。

圖1 浙貝乙素對5種人肝微粒體CYP酶亞型的抑制曲線Fig.1 Inhibition curves of five CYP isoforms in HLMS by verticinone

3 討論

在藥物開發的早期階段，使用體外混合探針底物法進行人肝微粒體孵育實驗，可以經濟、省時、高通量地獲得候選化合物對體外肝微粒體CYP酶活性的影響，以期在綜合考慮藥理活性和對代謝酶影響等基礎上篩選出藥理活性高而又不易引起代謝性相互作用的候選藥物。理想的用于檢測CYP同工酶的探針底物應該對特定的CYP酶亞型具有優良的選擇性、敏感性以及可獲得性，本實驗選擇的探針底物均為美國藥品研究和制造商協會(PhRMA)推薦使用的體外探針底物[8]。CYP3A4的配體結合位點具有顯著的催化區域專一性，并對改變底物特異性、蛋白結構及協同性具有不同的作用[9]，因此在進行體外考察藥物對CYP3A4活性的影響時，建議至少選擇兩種結構不相關的探針底物，因此本實驗中選擇睪酮和咪達唑侖兩種底物來考察浙貝乙素及其膽酸酯對CYP3A4的抑制作用。

圖2 浙貝乙素膽酸酯對5種人肝微粒體CYP酶亞型的抑制曲線Fig.2 Inhibition curves of five CYP isoforms in HLMS by verticinone

筆者采用本實驗室前期建立的成熟的體外混合探針底物法，對具有良好鎮咳、祛痰活性的浙貝乙素及其衍生物浙貝乙素膽酸酯進行了對人肝微粒體CYP酶活性影響的考察，結果表明浙貝乙素對考察的5種CYP酶亞型基本沒有或僅有很弱的抑制作用，而其衍生物浙貝乙素膽酸酯對考察的5種CYP酶亞型具有較強的抑制作用，表明浙貝乙素膽酸酯在藥物代謝性相互作用方面的安全性不如其母體(浙貝乙素)。浙貝乙素膽酸酯對 CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的抑制作用類型，尚需進一步的酶促動力學研究才能說明。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:327－328.

[2]吳繼洲，張勇慧，阮漢利，等.湖北省貝母屬植物資源、化學及生物活性的研究[C].北京:第八屆全國中藥和天然藥物學術研討會與第五屆全國藥用植物和植物藥學學術研討會論文集，2005:173－175.

[3]張勇慧，阮漢利，曾凡波，等.湖北貝母鎮咳、祛痰、平喘藥效部位的篩選[J].中草藥，2003，34(11):1016 －1018.

[4]錢伯初，許衡均.浙貝母堿和去氫浙貝母堿的鎮咳鎮靜作用[J].藥學學報，1985，20(4):306 －308.

[5]ZHANG J L，WANG H，CHEN C，et al.Addictive evaluation of cholic acid-verticinone ester，a potential cough therapeutic agent with agonist action of opioid receptor[J].Acta Pharm Sin，2009，30(6):559 －566.

[6]周慶，皮慧芳，張鵬，等.浙貝乙素膽酸酯的鎮咳和祛痰藥效學觀察[J].中國醫院藥學雜志，2011，31(5):388－391.

[7]YAMAZAKI H.Drug interaction studies in the 21st century:research into cytochrome P450，transporters，and simulations informing their role in drug-drug interactions[J].Drug Metab Pharmac，2007，22(4):223 －224.

[8]BJORNSSON T D，CALLAGHAN J T，EINOLF H J，et al.The conduct of in vitro and in vivo drug-drug interaction studies:a pharmaceutical research and manufacturers of A-merica(PhRMA)perspective[J].Drug Metab Disposition，2003，31(7):815 －832.

[9]RACHA J K，ZHAO Z S，OLEJNIK N，et al.Substrate dependent inhibition profiles of fourteen drugs on CYP3A4 activity measured by a high throughput LC MS/MS method with four probe drugs，midazolam，testosterone，nifedipine and terfenadine[J].Drug Metab Pharmac，2003，18(2):128 －138.