家鵝線粒體細胞色素b的同源建模與結構分析

陳艷榮

（黃山學院生命與環境科學學院，安徽 黃山 245041）

王繼文

（四川農業大學動物科技學院，四川 雅安 625014）

線粒體細胞色素b（Cyt b）是構成線粒體細胞色素bc1復合體的蛋白質之一，也是其中唯一由線粒體基因組編碼的蛋白質，它轉移2種不同形式的血紅素:高電位式 （bH）和低電位式 （bL）。這些血紅素分別位于線粒體內膜的內側和外側，形成了輔酶Q的2個氧化還原位點 （Q0、Q1）間的跨膜電子循環［1－3］。目前對于Cyt b在電子傳遞鏈中的復雜功能仍不盡清楚［3］。Cyt b是一個橫貫膜兩側的極端疏水性的蛋白，與線粒體內膜結合極為緊密，很難將其單獨分離［4］。由于具有較強的疏水性，不易結晶，采用常規的晶體學方法研究其結構和功能效率較低［5］。同源建模 （比較建模）是目前唯一能夠從蛋白質的氨基酸序列 （目標序列）出發，建立3D模型的計算方法［6］。蛋白質的結構比蛋白質的序列更保守，如果2個蛋白質的氨基酸殘基序列有50%相同，那么約有90%的α碳原子的位置偏差不超過3%。這是同源模型化方法在結構預測方面成功的保證［7－8］。

本研究通過利用結構已知的Cyt b家族成員 （模板）預測新序列的結構，建立序列與相應結構和功能間的聯系，從而用較低成本和較短時間預測出家鵝 （Anser domestica）Cyt b蛋白質結構和功能。

1 材料與方法

1.1 數據來源

本研究測定了中國家鵝和歐洲鵝 （Anser domestica）（15個中國家鵝品種、2個歐洲家鵝品種共17個品種）44個體的Cyt b基因全序列 （GenBank登錄號:AY427816），使用軟件DNASTAR將其翻譯成氨基酸序列，在GenBank中Blast并下載其他物種Cyt b氨基酸序列，合并通過肉眼和程序CLUSTAL W進行多重排序，推導出氨基酸序列。

1.2 同源建模

選用SWISS－MODEL蛋白質比較建模服務器進行 Cyt b的三級結構預測 （http:／／swissmodel.expasy.org）選擇簡捷模式 （First approachmode）直接通過web界面提交所測氨基酸序列，服務器會完全自動地為目標序列建立模型；若一條模板與提交的目標序列相似度大于25%，建模程序就會自動開始運行。

利用DeepView軟件、Antheprot＿3D＿viewer軟件并搜索PDF和PROISTE數據庫，對所預測的Cyt b高級結構進行觀察和分析，定位活性位點。

2 結果與分析

2.1 預測結果

經過數據庫搜索和同源性查找，ID為1bccC結構被作為建模的模板，它與目標序列具有90%的高序列同源性，三級結構較為相近，這為同源建模提供了可能。模建結果如圖1。

圖1 同源建模預測的Cyt b三級結構

預測結構包含8個較大的α螺旋，應該就是Cyt b蛋白跨膜結構，它們被4個長的松散結構（LOOP）和3個短的易變區連接在一起，另外還有4個較小的螺旋，2個小的β－折疊片層。ANOLEA被用來評估模型的裝配質量，計算多肽鏈能量，評測蛋白分子的每個原子 “非局部環境 （NLE）；VERIFY3D使用三維輪廓評估蛋白質結構，依據三維結構演算還原被測序列，計算氨基酸序列 （1D）和三維結構 （3D）間的相容性。利用以上2種方法評估所得預測結構，得出符合評估有利條件的氨基酸殘基占全部殘基的90%，說明建模的結構基本合理。

2.2 Ramachamdran圖和分子表面

Ramachamdran圖顯示主鏈98.1%的Ψ、Φ角落在核心區和允許區，即藍線封閉區，說明模建的結構合理。從圖2可以看出，落在 （－60°，－60°）區域中落入殘基密度最大，這是反映右手α螺旋的區域，說明Cyt b蛋白結構是以α螺旋為主，這與二級結構預測一致。

通過分子表面的有關計算得知，該分子面積為17870?2，體積為49028?3；含有2個洞穴 （cavity），一個較大，面積為184?2，體積為168?3（圖3紅線區），另一個較小，面積和體積分別為42?2和20?3（圖3綠線區），一般來說，分子表面的洞穴很可能是底物結合的部位，附近的氨基酸極有可能為活性位點。

圖2 拉氏構象圖

圖3 分子表面的洞穴

2.3 靜電勢預測

從靜電勢分布來看，Cyt b分子表面靜電勢比內部高；存在2處較強的正電勢區和兩處相對較弱的負電勢區，正電勢含堿性氨基酸殘基的數量較大 （圖4）。ALA2～HIS9等殘基形成的松散區呈正電勢，另一處正電勢區范圍較大，預測的2個洞穴都位于正電勢區，即該區的靜電勢有一部分可能來自于活性位點周圍的蛋白質原子，可能的活性殘基具有大的電荷密度，故有較強的結合受體或與其他蛋白相互作用的能力，值得注意的是，在SER28、ILE29、SER206、ASN207、ASN208等殘基處存在靜電勢的極值，ALA59、PHE63、ASP 64和SER65等殘基也有此現象，推斷很可能與特定的電子傳遞功能有關。

圖4 靜電勢預測

2.4 保守區的查找

利用NCBI的Blast進行同源性查找，可獲得序列的保守Domain（CD）。結果發現，Cyt b蛋白有2個結構域，分別為Cyt B＿N和CytB＿C，前者包含序列N端10～207位的氨基酸殘基，搜索到3個活性部位:（1）血紅素bH結合部位，包括31、34～35、37、38、90、94、97、98、100、112、113、116、117、119、120、193、197、200、205和206等多個位點殘基； （2）血紅素bL結合部位，包括441、44、45、48、49、51、52、55、66、80、83、84、87、126、127、130、131、133、134、182、183、186等位點殘基； （3）Qi結合部位，包括121、124、125、128、129、142、145、146、150、178和181位點殘基。后者包含序列N端208～355位的殘基；2個活性部位:（1）Qi結合部位，包括268、270、271、274、277、278和294位點的氨基酸；（2）Qo結合部位，包括220和228位點殘基。

目標序列與模板1bccC序列同源性達到90%，將兩者的結構疊印進行比較 （圖5），紅色的為模板結構，白色的為Cyt b預測結構；Cyt b與模板1bccC之間拓撲等價殘基的Cα原子距離均方根差（RMS）為0.08?，從圖5可看出2個血紅素結合位點 （箭頭處）。

另外，在PROFILESCAN服務器搜索PROSITE庫，對蛋白質中的相似結構位點、功能域進行搜索，可得到一系列具有相似結構位點或功能域的已知的蛋白質序列 （表1）。

由表1可知，該氨基酸序列中包含6個功能位點。但是，除后2個位點外，其他的一些結構和功能位點由于序列較短，更可能是隨機匹配的結果。PS00197與NCBI庫搜索到的血紅素bL位點有部分重合，而PS000193則NCBI中搜索的Qo結合位點亦有重疊。

3 討論

預測結果顯示，Cyt b蛋白高級結構是α螺旋為主的。這和目前大部分研究結果一致。Kubota等［9］研究了牛心線粒體的Cyt b晶體結構，認為Cyt b蛋白由2個β－折疊，13個α螺旋，其中的9個螺旋組成Cyt b的跨膜結構；Gao等［10］2003年修正了這個模型，把9個跨膜螺旋減為8個，并把推斷的兩性螺旋定位在N末端。Zhang等［11］研究了雞的Cyt bc1復合物，共確定了12個跨膜螺旋，把其中的8個分配給了Cyt b蛋白，現在大部分研究都支持這一模型。根據靜電勢分析結果，由于正電勢區堿性氨基酸殘基的數量較大，導致了具有較強的正電性，正電荷越多，越不利于分配在水相中，形成了較明顯的疏水區［12］。本研究所預測Cyt b結構中，8條長的螺旋幾乎都有部分區域被分配在正電勢區，可以確定其跨膜結構特征。

圖5 Cyt b與1bccC結構疊印圖

表1 ScanProsite搜索得到的結構和功能位點

細胞色素bc1復合物由Cyt b、Cytb C1和鐵硫蛋白 （ISP）組成，主要作用是將電子從輔酶QH2（CoQH2）轉移到Cyt c，具體步驟:CoQH2（來自復合物1）先與Cyt b特殊部位結合，將1個電子轉移給ISP，并將它的2個質子釋放到膜間空間，產生半醌離子 （CoQ－），ISP將其獲得的電子傳遞給Cyt C，而CoQ－則把它保留的1個電子轉移給Cyt b上的血紅素，產生完全氧化的CoQ，CoQ從原來的結合部位脫落，轉移到Cyt b的另一結合部位，在該處接受被Cyt b血紅素還原的電子，再轉變成CoQ－，完成在復合物的電子傳遞。Cyt b為完成自身功能必要涉及到幾個結合位點:即CoQH2、CoQ等不同形式出現的輔酶Q的結合位點 （Qo和Qi），氧化電勢的血紅素、還原電勢的血紅素結合位點（bH 和bL）［13－14］。

抗菌素A能結合到細胞色素BH附近，阻止電子從BH向輔酶Q傳遞，這就是證實Qi部位的存在。Esposti等［15］研究得出:Qi結合部位在Cyt b的bH附近，位于1個由血紅素、3條跨膜螺旋和1條兩性表面螺旋組成的洞穴內，經由保守性組氨酸 （或組氨酸附近）與線粒體基質發生可能質子性聯系。本研究目標序列與模板序列的對比中所定位的Qi結合位點沒有那么復雜，正確與否還待進一步研究。

Cyt b蛋白與血紅素是以非共價鍵結合的。Xia等［16］、Iwata等［17］研究了牛心線粒體Cyt bc1復合物，認為血紅素被填充在由位于其周圍的4個螺旋捆束成的空間內，這種結構可以更好地防止血紅素被溶解，也更有利于血紅素附近的基團和4個精氨酸形成更強烈的靜電互作。本研究中搜索RPOSITE庫時血紅素配基信號，結合目標序列與模板序列比對，并將預測結構與模板結構疊印，粗略確定了bH和bL位點；但結合靜電勢預測發現，這2個位點與表觀靜電勢分布似乎關聯不大，幾處電勢較強的位置似乎更和Cyt bc1復合物的其他亞基結合有關；關于活性位點定位及精細位置還待以后進一步研究。

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