雙向電泳蛋白質組技術在殘胃癌組織研究中的應用

孫余省+朱冠保+陶禮鈞+方軍+徐洪波+林才

[摘要] 目的 探討雙向電泳蛋白質組技術在殘胃癌組織研究中的應用效果。 方法 選取3對殘胃癌及癌旁正常胃黏膜組織，利用雙向電泳蛋白質組技術對其進行研究。 結果 獲得了質量良好的胃癌組織蛋白質組雙向電泳圖譜。分析之后可得，癌旁組織平均984個蛋白點，殘胃癌組織凝膠平均1068個蛋白點。一共有112個差異表達的蛋白點，其中，顯著差異（表達差異2倍以上）的蛋白點42個。在這42個蛋白點之中，在殘胃癌組織里表達上調的一共有17個點；在殘胃癌組織里表達下調的一共有14個點；在殘胃癌組織中失表達的一共有8個點；僅在殘胃癌組織中表達的一共有3個點。 結論 利用雙向電泳蛋白質組技術對殘胃癌組織進行研究可以獲得良好的應用效果。

[關鍵詞] 殘胃癌；蛋白質；雙向電泳蛋白質組技術

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）08（c）-0020-05

Application of two-dimensional gel electrophoresis proteomics in residual gastric cancer tissue study

SUN Yusheng1 ZHU Guanbao2 TAO Lijun1 FANG Jun1 XU Hongbo1 LIN Cai3

1.Department of Traumatology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Zhejiang Province， Wenzhou 325000， China； 2.Department of General Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Zhejiang Province， Wenzhou 325000， China； 3.Department of Burns， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Zhejiang Province， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To explore the application effect of two dimensional electrophoresis proteomics techniques in the study of residual gastric cancer tissue. Methods 3 pairs of residual gastric cancer and adjacent normal gastric mucosa tissues were selected， and were studied by two-dimensional electrophoresis technology in proteomics. Results Gastric tissue of two-dimensional gel electrophoresis profiles of good quality was obtained. The average of protein spots of adjacent mucosa were 984， the residual gastric cancer tissue were 1068 after the analysis of available. There were 112 protein spots differentially expressed in total， and 42 protein spots were significantly different （expressed more than 2 times）. There were 17 protein spots in total raised in gastric cancer tissue； 14 protein spots in total cutted； 8 protein spots in total loss of expression； and 3 protein spots in total expressed only in the residual gastric cancer tissue among 42 protein spots. Conclusion Application of two-dimensional electrophoresis technology for residual gastric cancer tissue study can obtain good effect.

[Key words] Gastric stump cancer； Protein； Two-dimensional electrophoresis technology in proteomics

殘胃癌亦稱胃術后胃癌，占所有胃癌的0.35%～5.8%。它常發生于胃大部切除后的殘胃內，也可發生在單純胃腸吻合等術后的全胃內。胃大部切除術后20年以上，殘胃癌發生率較一般人群高出6～7倍[1-3]。迄今為止，其發病的分子機制仍然不明，也沒有好的早期診斷方法。因此，尋找特異的分子標志和早期診斷方法，了解殘胃癌的發病機制對治療和預后的判斷都有非常重要的意義[4-6]。本研究采用雙向電泳技術分離殘胃癌組織與癌旁正常胃黏膜組織的所有蛋白質，運用蛋白質組學技術分析殘胃癌組織與癌旁組織之間蛋白質組的表達差異，尋找殘胃癌的特異性標志物，分析差異表達蛋白譜的變化與殘胃癌的發生發展之間的關系、規律，為全面闡明殘胃癌的發病機制和臨床殘胃癌篩查和診斷以及治療提供新的途徑。endprint

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 標本采集

2010年2月～2011年12月取3對殘胃癌及癌旁正常胃黏膜組織，均來自溫州醫學院附屬第一醫院胃腸外科收治的經手術切除的殘胃癌患者，其中女2例，男1例，年齡59～75歲，平均67歲。3例患者均經術后病理學檢驗，確診為胃術后“吻合口”低分化腺癌。從腫瘤的非壞死組織中獲得殘胃癌組織作為觀察組，并從患者距離原發腫瘤在5 cm以上的胃黏膜層組織獲得正常組織作為對照組。其中，所有癌旁正常胃黏膜組織標本均經病理學檢驗，證實不存在癌細胞浸潤。所有殘胃癌組織標本經病理學檢驗，證實腫瘤浸潤僅穿透漿膜層。待所有標本離體之后，立即予以取材，并利用生理鹽水沖洗多次之后放入液氮中。將所有標本均置于-80°C的環境下，儲存備用。

1.1.2 主要試劑

固相pH梯度干膠條（13 cm，寬pH范圍）、IPG buffer購自通用電氣醫療集團生命科學部；丙烯酰胺、甘氨酸、甲基雙丙烯酰胺均購自上海醫藥（集團）有限公司信誼制藥總廠；十二烷基硫酸鈉（SDS）購自湖北鴻運隆生物科技有限公司；尿素購自張家港豐達制藥有限公司；3-[3-（膽酰胺基丙基）二甲氨基]丙磺酸鹽、過硫酸銨和N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）均購自北京瑞達恒輝科技發展有限公司；3-[（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）、二硫蘇糖醇（DTT）均購自上海嶸崴達實業有限公司；碘乙酰胺購自武漢濟森醫藥化工有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；UPD-D蛋白質染料染色試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；UPD-蛋白質染料染色試劑盒購自溫州安得森生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器

超聲波細胞粉碎機（購自寧波先倡電子科技有限公司）；IPGphorⅢ等電聚焦儀器（購自上海將來實驗設備有限公司）；DYY-6C雙穩定時電泳儀（購自安徽東南儀誠實驗室設備有限公司）；脫色搖床[購自創博環球（北京）生物科技有限公司]；冷凍臺式高速離心機（購自江蘇省金壇市恒豐儀器制造有限公司 ）；SDS-PAGE垂直電泳儀（購自北京君意東方電泳設備有限公司）；Powerlook 2100XL掃描儀[購自世群國際貿易（上海）有限公司]，ImageMaster 2D platinum 6.0圖像分析軟件（購自通用電氣醫療系統貿易發展上海有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取組織總蛋白

將組織標本100 mg快速浸于液氮之中，充分研磨，達到粉末狀后，加入裂解液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，40 mmol/L Tris，0.5% TritonX-100， 65 mmol/L DTT，0.5%pharmalyte，1%蛋白酶抑制劑cocktail）1 mL。予以渦旋振蕩，達到混勻充分之后，置冰上進行1 h裂解。應用超聲細胞破碎儀處理10 min，避免出現氣泡，然后以15 000 r/min，4℃進行30 min離心。組織總蛋白質提取液即為最終的上清液。利用BCA試劑盒對蛋白的濃度進行檢測，并進行分裝，然后置于-80℃環境下存放備用[7]。

1.2.2 凝膠電泳

1.2.2.1 水化上樣 從水化盤槽的邊緣，從左至右，線性加入250 μL樣品。取出存放在冰箱中的IPG膠條，置于室溫環境下10 min。然后將膠條膠面朝下，輕輕放置在水化盤中的樣品溶液上。靜置30～45 min，待膠條吸收大部分樣品之后，將礦物油沿膠條緩慢加入。每根膠條（17 cm IPG）在3 mL左右，避免水化過程中液體蒸發。將等電聚焦儀于-20℃予以11～15 h水化。

1.2.2.2 第一向等電聚焦 于聚焦盤的正負極上放置紙電極置，加5～8 μL ddH2O進行潤濕。取出水化完畢的IPG膠條，放在聚焦盤中。并利用2～3 mL礦物油覆蓋每根膠條。對等電聚焦程序進行設置，具體如下：50 V，4 h；100 V，3 h；500 V，1 h；1000 V，1 h；5000 V，1 h；8000～50 000 V，10 h，重復3次。待聚焦結束之后，將膠條置于樣品水化盤中，并放在-20℃的冰箱中保存備用，或者立即對膠條予以平衡。電泳之前，將膠條取出，并放置在室溫環境下予以溶解。

1.2.2.3 第二向 SDS-PAGE電泳 IPG膠條分別置于10 mL平衡緩沖液Ⅰ（6 mol/L 尿素，2%SDS，0.05mol/L Tris-HCl， pH 8.8， 30% 甘油包含2%二硫蘇糖醇）和平衡緩沖液Ⅱ（250 mg碘乙酰胺的平衡液）搖床上各平衡15 min，在1×電泳緩沖液中漂洗數次，然后安放在12%的丙烯酰胺凝膠上，加入低熔點瓊脂糖封膠液封閉。先進行10 mA/17 cm，15℃電泳。仔細觀察，在樣品在全部走出IPG膠條并濃縮為一條線之后，增大電流強度，保持在20～30 mA/17 cm。再次予以觀察，如果溴酚藍指示劑到達底部邊緣，即表示電泳完成[8]。

1.2.2.4 染色 利用UPD-蛋白質染料染色試劑盒進行染色。在完成電泳之后，對凝膠予以小心的剝離，并置于蒸餾水中進行漂洗，并嚴格參照產品說明書中的具體步驟染色。

1.2.2.5 掃描分析圖像 利用光密度投射模式完成掃描，并以TIF格式予以妥善保存。利用分析軟件對圖像予以分析。比較3塊重復的膠圖，合成標準圖譜。采用軟件進行兩兩對比分析，如果表達量差距在2倍以上，則視為存在明顯的差異表達，并得出差異表達蛋白點的具體數據[9]。

2 結果

2.1 蛋白雙向凝膠電泳

對3對殘胃癌和癌旁組織分別進行了多次重復雙向凝膠電泳，選取背景清晰、分辨率高、無扭曲、拖帶的膠圖各3張，共18張進行分析。利用ImageMaster 2D platinum 6.0軟件進行分析之后可得，癌旁組織平均984個蛋白點，殘胃癌組織凝膠平均1068個蛋白點。進行多對兩兩比較之后可得，在匹配的蛋白點方面，癌旁組織一共有883個蛋白點，殘胃癌組織一共有886個蛋白點。癌旁組織和殘胃癌組織的平均匹配率分別為89.8%和81.8%。殘胃癌組織和癌旁組織的蛋白雙向電泳凝膠圖見圖1。18塊凝膠的蛋白點統計情況見表1。endprint

正常癌旁組織 殘胃癌組織

X軸為pH值分布，Y軸為分子量分布

圖1 2-D電泳凝膠圖

表1 18塊凝膠的蛋白點統計

注：十位數為患者編號，個位數為組織標號，單數為殘癌組織，雙數為癌旁組織

2.2 殘胃癌組織中差異表達的蛋白情況

通過膠圖比對和軟件分析，將所有殘胃癌組織的膠圖合成一個虛擬膠圖，同樣所有癌旁組織膠圖也合成為一個虛擬對照膠圖，再進行比較。在殘胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織中發現兩者間共有112個差異表達的蛋白點，其中顯著差異（表達差異2倍以上）的蛋白點42個。在這42個蛋白點之中，在殘胃癌組織里表達上調的一共有17個點；在殘胃癌組織里表達下調的一共有14個點；在殘胃癌組織中失表達的一共有8個點；僅在殘胃癌組織中表達的一共有3個點。部分差異表達蛋白見圖2。

3 討論

機體的各種正常生命活動或者異常的疾病發生過程都是各種復雜因素相互作用的結果，其中以各種蛋白質的相互作用最為重要，因為蛋白質是生命的組成和生命活動的物質基礎[10-11]。全面研究各種蛋白質在疾病的發生過程中的變化比單一研究某個蛋白的作用無疑具有更大的優勢，更能準確、全面了解真實的疾病發生原理。1994年，“蛋白質組（proteome）”概念誕生。該概念是由澳大利亞學者Williams以及Wilkins經過大量的研究提出的，并認為蛋白質組指的是對一種組織或者細胞中所有蛋白質的相關研究[12]。隨著現代研究的不斷深入，蛋白質組相關理論研究和技術水平等都得到了較大的發展，被廣泛應用于對各種疾病的發生和發展的研究之中，成為一種重要的研究工具，尤其是在人類基因組計劃完成之后，“組學”研究更是成為生命科學的重要研究方向。在功能基因組以及后基因組的研究過程中，蛋白質組的研究又顯得尤其重要，因為蛋白質才是絕大數基因功能的最終執行者[13]。目前國際國內對胃癌的研究中，有許多的學者都已經采用蛋白質組學技術在蛋白水平上大規模的研究腫瘤特異性的蛋白表達變化，如國內學者Li等[8]2008通過蛋白質組研究發現胃癌組織中表達上調的蛋白主要集中在：①轉錄調節蛋白，如鋅指蛋白；②信號轉導蛋白，如G蛋白信號3蛋白（RGS3）；③腫瘤相關蛋白，如ras相關蛋白；④細胞骨架蛋白，如大皰性類天皰瘡抗原1。一些學者也做過類似的胃癌比較，發現了很多類型的胃癌中表達上調的蛋白，例如轉膠蛋白和熱休克蛋白27及其異構體，以及抗增殖蛋白和NSP3，還有葡萄糖代謝相關蛋白以及二硫化物異構酶A3蛋白等。而表達上調的蛋白也有很多類型，例如P20和二磷酸核酸異構酶A，以及載脂蛋白A-1和抗胰蛋白酶等。另外，血清轉鐵蛋白是表達下調的蛋白[14]。

目前針對殘胃癌組織與癌旁組織的蛋白質組研究還未見報道。本研究在提取殘胃癌組織蛋白的過程中，筆者予以了適當的提取優化，即將組織標本快速浸于液氮之中，充分研磨，達到粉末狀后，加入裂解液，并予以渦旋振蕩，達到混勻充分。這樣的提取過程可以對蛋白質的溶解性予以改善。同時在裂解處理后，采用超聲破碎處理，克服提取液中由于包含基因組DNA而比較黏稠，會影響后期電泳結果，造成拖帶現象的缺點[15]。研究結果顯示，2-D膠圖上背景較少，蛋白質點清晰，重復性較好，達到進一步分析的要求。另外，在研究蛋白質組的過程中，凝膠蛋白質染色技術會對最終的質譜分析等產生較大的影響。因此，研究過程中，還需要做好染色環節。本研究中，筆者即利用UPD-蛋白質染料染色試劑盒進行染色。在完成電泳之后，對凝膠予以小心的剝離，并置于蒸餾水中進行漂洗，嚴格參照產品說明書中的具體步驟染色。

同時，本研究采用以相同的實驗條件、相同的試劑和實驗參數同時研究癌組織和癌旁組織，從凝膠圖譜上看，具有很好的重復性和可比性，也證明了雙向電泳技術分離蛋白質的效果良好，是研究癌癥組織蛋白質組的有力工具。本研究的第一向等電聚焦采用了pH 3～10的IPG膠條，基本上覆蓋了絕大部分的殘胃癌組織和癌旁組織表達的蛋白質譜，能夠全面反映其蛋白質組的分布。但是，在膠圖中也發現，大部分的蛋白質多集中在pH 5～8之間，給具體的分析過程帶來一定的難度。于是，分析的過程中，高豐度表達的蛋白可能會對于低豐度表達的一部分蛋白質造成不同程度的掩蓋。因此，進一步的研究應該繼續采用高分辨的窄pH范圍的膠條，比如pH 3～8， pH 7～10的膠條來做進一步的分離。雙向電泳分離蛋白質只是蛋白質組研究的第一步，下一步應該采用各種蛋白酶切加質譜分析技術，例如MALDI-TOF-MS等來對出現差異表達的蛋白點代表什么蛋白質予以進一步的鑒定，并進一步分析其代謝途徑和信號通路，即所謂的Pass way分析。通過更加深入的分析研究，爭取了解疾病的發病機制，才能進一步發現新的治療策略和診斷方法[16]?？傊?，在各種人類重大疾病的預防診治研究過程中，蛋白質組學是一個十分重要的研究課題，可以提高人們“全景式”病理機制認識水平。另外，關于蛋白質組學的研究還具有極強的研究前景，各種新型藥物靶標與藥物的研發將會給各種疾病患者帶來巨大的福音，并為各種疾病對治療提供新的思路。

綜上所述，利用雙向電泳蛋白質組技術對殘胃癌組織進行研究，可以獲得質量良好的胃癌組織蛋白質組雙向電泳圖譜，應用效果良好。

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（收稿日期：2014-04-21 本文編輯：程 銘）endprint

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（收稿日期：2014-04-21 本文編輯：程 銘）endprint

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（收稿日期：2014-04-21 本文編輯：程 銘）endprint