3D重組皮膚模型研究進展與OECD新規

在眾多的人類組織工程學體外模型皮膚中，皮膚組織的三維（3D）重組模型是其中最完善的模型之一。制藥業和化妝品行業對于動物模型的替代方法巨大的需求，推動了皮膚模型的發展進步。2013年7月26日，經濟合作與發展組織

（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）再次更新試驗指南TG43l和TG439，對于使用3D皮膚模型進行體外皮膚腐蝕性、刺激性試驗，提出更具體的要求。本篇綜述重點介紹由角質細胞構成的重組表皮模型（Reconstructed Human Epidermis Made of Keratinocyte，RHE），概述其檢測原理，以及OECD對于應用此類體外模型的最新標準。簡單介紹其他種類的皮膚模型，并對我國目前動物試驗替代方法的研究成果和前景進行討論和總結。

關鍵詞：皮膚模型，動物試驗替代方法，OECD規則

引言

皮膚作為人類最大的器官，包含多種類型的細胞，這些細胞相互影響，協同作用，構成阻擋有害物質進入機體的第一道天然屏障。角質層作為皮膚屏障作用的主要執行者，是由表皮層基底的角質細胞不斷分化而來（如圖1）。在表皮層中，除了角質細胞，還有黑色素細胞和朗罕氏細胞。表皮層通過一層基膜與其下面的真皮層相連接。真皮層分為乳突層和網狀層，前者含有的膠原纖維排列疏松，后者的膠原纖維排列致密并且與皮膚表面平行。這些膠原纖維由成纖維細胞產生，含有大量的彈性蛋白，為皮膚提供彈性。不同于表皮層沒有血管的結構，真皮層內富含血管、淋巴管、神經、汗腺、皮脂腺和毛囊。

皮膚的疾病可能由多種原因造成，比如細胞代謝紊亂、傳染病，對外界抗原的免疫性反應或是物理性、化學性的傷害。病因的多樣性和復雜性使得在藥物研發領域，對于體外皮膚模型的需要日益增長。另外，出于法律和道德的要求，國外化妝品行業同樣重視體外皮膚模型的使用。2013年7月26日，經濟合作與發展組織（Organization for Economic Co-operation andDevelopment.OECD）再次更新試驗指南TG431和TG439（以下簡稱2013版指南），對于體外皮膚腐蝕性、刺激性試驗提出更詳盡的要求。

大量的研究促使人類皮膚模型不斷進步，從依靠滋養層培養到表皮替代物以及多種類型細胞共培養系統。目前皮膚模型主要分為兩大類，一類是致力于開發更為精細復雜的皮膚模型，用于皮膚疾病的治療，培養條件和結果判定也相應的更復雜。已經建立的比較好的模型是包含有角質細胞和成纖維細胞的全皮模型（fullthickness.FT），還有更為復雜的加入了其他類型細胞（如黑色素細胞，干細胞，朗罕氏細胞）或者可以與其他器官相互作用的模型。第二類則是已經進入量產并且經過驗證的由角質細胞構成的重組表皮模型，主要用于風險評估，具有很好的可重復性。本文將重點討論第二類皮膚模型，并簡單介紹其他模型。

由角質細胞構成的重組表皮模型

1.概況

為滿足研究者和工業界對于皮膚模型不同的需求，現有的皮膚模型有多種類型。最基本的是只含角質細胞的皮膚模型，即由角質細胞構成的重組表皮模型（Reconstructed HumanEpidermis Made of Keratinocyte.RHE）。RHE是在特定條件下培養人類角質細胞，并通過氣液面培養的方式得到角質層，基本具有類似于人表皮的組織結構（如圖2）。

1998年，首批皮膚模型（EpiSkin和EpiDerm^TM）被替代方法歐洲研究中心（EuropeanCentre for the Validation of AlternativeMethods.ECVAM）批準用于皮膚腐蝕性預測，并于2004年隨著OECD試驗指南的出版而在國際上被廣泛接受。不久之后，其他滿足經合組織試驗指南要求的模型陸續被批準。2008年經過調整的EpiDerm SIT和SkinEthic被批準用于皮膚刺激性預測。

2.檢測原理

RHE對于有潛在腐蝕性或刺激性物質的預測是通過檢測細胞存活率的方法來實現。即待檢測物質滲透至角質層以下的細胞層，如果對活細胞產生毒性作用，就會導致部分細胞死亡。使用3-（4.5-二甲基噻唑-2）-2.5二苯基四氮唑溴鹽（簡稱MTT）檢測，根據試驗組吸光值（OD值）和陰性對照組的比值，確定細胞活率的變化。當待測物質對于活細胞有刺激作用時，細胞會分泌系列迅速引起皮膚炎癥的因子，如IL-1α，對其定量分析可以輔助評估細胞受到刺激的程度和體外炎癥起始的級聯反應/作用機理。所以對于刺激性物質通常會選用MTT和IL-1α雙終點判定。

3.OECD 2013版指南對于皮膚模型的基本要求

RHE主要目的是對待測物質進行毒性預測和評估，所以必須保證試驗結果的可重復性。在2013版試驗指南中，OECD提出了皮膚模型的“執行標準”（performance standard），規定如果向OECD申請認證新的或類似的皮膚模型，必須符合此“執行標準”。其中關于皮膚模型的質量制定了五項基本標準，概況如下：

1）細胞活性：每批次的RHE必須達到規定的陰性對照標準，即細胞活率達到特定數值。不同生產商標準有所不同，如表1，OD值過低，說明RHE自身活細胞數目少，活率低，可能無法真實反應待測物質的腐蝕性或刺激性；相反，如果OD值太高，說明RHE細胞數量過多，可能對于毒性有耐受，同樣無法獲得真實結果。

2）屏障作用：角質層及其脂質結構產生的屏障作用能夠在一定程度上抵擋特定有害物質的快速滲透。一般使用SDS或者1%Triton-100作用于RHE表面，計算細胞活率下降50%所需要的時間（ET₅₀）或者劑量（C₅₀），兩個值需在定范圍內（如表2），過低或者過高表明角質層太薄或者太厚，都不能真實預測待檢物質的毒性作用。endprint

3）組織結構：必須具備人表皮樣結構，即有基底層、棘細胞層、顆粒層和角質層。

4）可重復性：陽性對照和陰性對照的試驗結果必須具有可重復性。

5）質量控制：需要將以上四點信息告知使用者，并保證每個批次的RHE各項指標均在規定范圍內。

另外，“執行標準”中針對皮膚腐蝕性/刺激性試驗。分別提供了參考化學品名錄（MinimumList of Reference Chemicals）。并且更改了腐蝕性試驗化學品的分類方法，由之前分為兩類（腐蝕性和非腐蝕性）改為三類（1A、1B-and-1C、和NC），1A代表強腐蝕性，1B-and-lC代表中等腐蝕性，NC代表非腐蝕性（如表3）。刺激性試驗化學品依舊分為兩大類——刺激性和非刺激性（如表4）。

4.OECD 2013版指南對于試驗操作的基本要求

對于應用RHE進行皮膚刺激性或腐蝕性試驗操作，2013版指南也提出具體要求，簡單概括以下幾點：

1）每個待測品有2～3個皮膚組織作為重復。

2）根據待測品性質和皮膚組織面積規定最少用量。

3）根據待測品種類選擇2個或3個暴露時問，對于刺激性化學品，一般暴露60分鐘，清洗再培養42小時后檢測；對于腐蝕性化學品，一般選擇3分鐘和60分鐘兩個時間點。

4）陰性對照可選擇生理鹽水或磷酸鹽緩沖液。

其他類型的重組皮膚模型

1.全皮模型（Full ThicKness，FT）

全皮模型通常包含有角質細胞、成纖維細胞以及膠原基質。通常是由膠原蛋白和人的皮膚成纖維細胞結合形成基質，然后將角質細胞培養于基質之上，同樣經過氣液面培養形成角質層。與表皮模型十分明確的培養條件不同的是，全皮模型的培養過程中加入血清（為了成纖維細胞的存活）。血清作為種天然產物，每批次的各種蛋白含量，如生長因子，都有可能不同，從而導致全皮模型批次問的差異。但是全皮模型的角質層屏障作用更強，得到的結果與體內試驗致性更好。

2.含有色素細胞的皮膚模型

由Duval等建立的含有色素細胞的皮膚模型，是迄今為止最為完善的且在生理學上被證明的皮膚模型。盡管黑色素細胞是最早被研究者試圖加入到皮膚模型中的細胞，但是因為角質細胞參與調解黑色素細胞的附著、存活和形態，所以經歷了將近30年，研究者才得到令人滿意的模型。含有色素細胞的皮膚模型，一方面將幫助制藥企業研發治療白癜風等疾病的藥物；另方面，將對化妝品企業研發美白產品起到幫助作用。

3.含有朗罕氏細胞的皮膚模型

因為皮膚是抵擋外界侵害的屏障，所以它也是免疫反應多發的部位。表皮中有促炎作用和免疫調節作用的細胞包括：角質細胞、黑色素細胞和上皮的樹突狀細胞（又名為朗罕氏細胞）。目前，對于含有朗罕氏細胞的皮膚模型，都集中于器官型培養，用于皮炎治療等方面的研究。

國內重組皮膚模型前景

盡管人類皮膚模型在國外已經有40多年的發展歷史，并已經形成法律規范，歐盟化妝品規程第7次修正案（2003/15/EC.2003）中規定，自2009年3月起在歐盟范圍內禁止使用動物進行化妝品毒性和過敏試驗，2013年起禁止使用動物進行化妝品原料的安全性評價，逐步不允許成員國從外國進口和銷售進行動物試驗的化妝品。但是在我國，動物試驗替代方法的研究仍處于起步階段，各類產品的皮膚安全性評價仍依賴傳統的動物試驗。

為建立與國際接軌、并符合我國目前研究水平和應用需求的化妝品毒理學安全性評價體系，提升我國突破化妝品國際貿易中技術壁壘的能力，2011年8月國家食品藥品監督管理局啟動了《化妝品動物試驗替代方法體系研究》項目。為實現該項目的研究目標，由中檢院、廣東出入境檢驗檢疫局、廣東省疾病預防控制中心有關技術人員組成專家組，進行了實地調研和座談，提出了我國《化妝品動物試驗替代方法體系研究》的研究報告。由廣東出入境檢驗檢疫局技術中心開發的《采用嵌入式培養法制備毒性檢驗用器官型人工皮膚的方法》（申請號：200810029210.8），以及由廣東檢驗檢疫局程樹軍等人開發的《利用干細胞筏式培養制備毒性檢驗用全層皮膚的方法》（申請號：200810030387.x）均獲得國家發明專利。

目前的報告都僅限于科學研究范疇，還沒有相應的商品化產品及服務。2012年，北京富龍康泰生物技術有限公司的研究人員開發出種商品化的3D重組皮膚模型，可用來評估化合物對于皮膚的刺激性或者腐蝕性。據目前所知，這是中國最早商品化的皮膚模型之，具有類似于人類表皮的組織結構，且符合OECD的5條質量標準。該皮膚模型培養在24孔板中，可以檢測所有劑型的化學物質，包括粉劑、液體和膏劑；用MTT和IL-1α雙終點檢測有效提高皮膚刺激性試驗和腐蝕性試驗的靈敏度、特異性和精確性。

人造重組皮膚模型有望代替動物模型，但是仍需要進步完善。特別針對中國地區人群皮膚特點的皮膚模型和商業產品開發幾乎處于空白，研究者們仍面臨巨大的挑戰。endprint