CIK細胞聯合紫杉醇治療上皮性卵巢癌的初步研究

肖梅 艾月琴 張闖 張燕 高艷榮 胡建華 賈紹昌

卵巢位于腹腔深部，目前缺少有效的診斷方法，首發初診時70%～80%患者已經是中晚期，在女性生殖器官惡性腫瘤中，其死亡率居于首位[1]。上皮性卵巢癌約占卵巢癌的90%，目前腫瘤細胞減滅術加紫杉醇/鉑類聯合化療的治療方法，可暫時緩解病情，然而復發率卻高達85%，晚期患者5年生存率仍然低于30%[2-3]。傳統認為，上皮性卵巢癌不具有免疫原性，近來研究表明，上皮卵巢癌患者體內存在免疫應答，更多的臨床證據顯示，抗腫瘤免疫效應與免疫逃避機制之間的關系預示著更好或者更差的生存率[4]。CIK細胞是將人外周血單個核細胞在體外用多種細胞因子誘導得來的一群異質細胞，兼有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和自然殺傷（nature kill，NK）細胞的非組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）限制性殺瘤的優點，是生物治療中常用的抗腫瘤效應細胞。本研究旨在探討上皮性卵巢癌患者中運用自體CIK細胞輸注同步紫杉醇化療的綜合治療方法的安全性和有效性。2011年11月-2013年11月，筆者對17例卵巢癌患者在紫杉醇+卡鉑治療時同步進行了多次自體CIK細胞輸注，檢測治療前后患者淋巴細胞亞群和血清細胞因子，觀察其臨床療效和不良反應，隨訪至治療結束后第3個月。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年11月-2013年11月共17例患者入選，均經病理證實為上皮性卵巢癌，其中12例為腫瘤細胞減滅術后仍殘存病灶>1 cm，均為術后2周內開始化療；5例為初診時無法手術，經2周期化療后行腫瘤細胞減滅術，仍殘存病灶>1 cm；12例治療開始時有腹水。年齡40～64歲，平均55歲。入選標準：年齡大于18歲的卵巢癌患者；重要臟器功能正常，無自身免疫疾病，卡氏評分在60分以上。排除標準：懷孕或哺乳期婦女，臟器移植者：如肝、心臟和腎等，嚴重的不可控制的感染，阻礙簽署及理解知情同意者。

1.2 主要材料 rhIL-1α為PeproTech產品，CD3單抗為古巴分子免疫學中心 （Cuba CIMAB S.A.）產品。rhIL-2購自北京雙鷺藥業。rhIFN-γ購自上海凱茂藥業，Ficoll分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司。無血清培養基GT551為寶日醫公司產品，內毒素檢測試劑盒購自湛江博康公司。流式抗體試劑為BD公司產品，細胞因子ELISA試劑盒為R&D Systems公司產品。

1.3 方法

1.3.1 CIK體外誘導 所有患者均于化療開始前1 d采血。采用費森尤斯卡比公司的血細胞分離機COM.TEC采集患者外周單個核細胞約60 mL，常規Ficoll分離外周血單個核細胞，重懸細胞后鋪于細胞培養瓶中，于培養瓶內加入含100 ng/mL rhIFN-γ的培養基，放置于37 ℃、5%CO2培養箱中。24 h后，添加終濃度 為 50 ng/mL CD3、50 ng/mL rhIL-1α、500 U/mL rhIL-2。培養過程中及時添加含500 U/mL rhIL-2的新鮮培養基。至培養的第10天、第12天、第14天收獲成熟CIK，通過形態學、特異性表面標記等進行鑒定，真菌、細菌、內毒素檢測合格后方可進行CIK回輸，同時終產品留樣備查。按《中華人民共和國藥典》2010版第三部規定的方法進行內毒素和無菌的檢測。以上操作均在符合GMP條件的實驗室進行。

1.3.2 方法 自體采血，次日開始化療，化學治療結束后第8天開始CIK回輸，每次間隔1天，共3次，每次（1～2）×109個CIK細胞。CIK回輸結束2周后進行第2次化學治療，同樣再次注射CIK，最少治療2個周期。化療方案為TC方案，當天給予紫杉醇135 mg/m2，>3 h靜脈滴注，次日給予卡鉑。卡鉑劑量根據患者腎功能情況確定，卡鉑（mg）=AUC×（GFR+25），GFR為患者的腎小球濾過率，單位為mL/min，AUC值取6。

1.3.3 臨床觀察 療程治療開始前l周及療程治療結束后2周內進行臨床評價，包括全面的病史采集，體格檢查及血常規、肝腎功能的檢查，嚴格觀察不良反應的發生情況。在每次細胞輸注后30 min及24 h，按《抗腫瘤藥物急性與亞急性毒性反應分度級標準》觀察患者是否出現不良反應。主要毒性反應為骨髓抑制、脫發、神經毒性和胃腸道反應。細胞免疫前2 d和細胞免疫結束后1周，用流式細胞儀檢測外周血CD3+、CD4+、CD8+等T淋巴細胞亞群和NK細胞的比率以及檢測血清Th1型細胞因子（IL-2、IFN-γ、TNF-α）的水平。按實體瘤治療療效評價標準RECIST標準進行評價[4]。

1.4 統計學處理 應用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行統計分析，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 T細胞亞群 治療后患者外周血T細胞亞群分析顯示，CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD56+細胞比例較治療前明顯升高（P<0.05），CD3+CD4+比例和CD4+CD25+Treg細胞比例下降，見表1。

表1 治療前后T淋巴細胞亞群變化（±s） %

表1 治療前后T淋巴細胞亞群變化（±s） %

*與治療前比較，P<0.05

時間 CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD3+CD56+ CD4+CD25+治療前（n=17） 57.23±13.20 31.53±13.03 35.16±15.12 12.35±5.28 2.48±1.02治療后（n=17） 63.69±14.52* 29.64±14.19 40.64±10.56* 16.17±5.18* 1.83±0.81

2.2 細胞因子水平的變化 患者治療前后Th1型細胞因子分析顯示，與治療前比較，治療后患者血清IL-2、IFN-γ、TNF-α水平顯著提高（P<0.05），其中以IFN-γ水平治療后升高最為顯著，見表2。

表2 治療前后細胞因子變化（±s） pg/mL

表2 治療前后細胞因子變化（±s） pg/mL

*與治療前比較，P<0.05；△與治療前比較，P<0.01

時間 IL-2 IFN-γ TNF-α治療前 28.4±18.9 17.95±9.30 29.6±12.3治療后 47.5±20.1* 48.2±21.2△ 43.7±14.8*平均升高倍數 1.67±0.90 2.68±2.30 1.85±0.80

2.3 近期療效 17例可評價病灶患者中，2例完全緩解（CR），13例部分緩解（PR），2例穩定（SD）。有效率（CR+PR）為88%。12例患者腹水緩解明顯。由于部分患者繼續接受化療影響，患者的生活質量改善情況無法評價。卡氏評分提高的患者有10例，其中尤以納差、食欲和睡眠改善最為明顯；體重增加有4例。2.4 毒性反應 未出現Ⅳ度粒細胞、血小板減少及Ⅳ度貧血。所有患者中，經預防性應用止吐藥物，16例患者發生輕微胃腸道反應；15例患者發生脫發；10例患者有肌肉酸痛手腳麻木畏冷等。CIK細胞輸注后，2例患者24 h內出現發熱，體溫均低于39 ℃，未給予特殊處理，在6～24 h內恢復正常，未出現惡心、嘔吐、頭痛等癥狀，未發現Ⅲ度及以上不良反應，表明細胞免疫治療是安全的，無明顯毒副作用。

3 討論

卵巢癌有強大的免疫逃避的能力，其腫瘤細胞與宿主免疫細胞網絡之間搭建了一個免疫抑制的腫瘤微環境。在腫瘤微環境中，免疫抑制作用增強，如調節性T細胞的水平，細胞因子如白介素-10（interleukin-10，IL-10）、 白 介 素 -6（interleukin-6，IL-6）、 轉 化 生 長 因 子 -β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平上調，從而促進腫瘤的生長，保護腫瘤細胞從治療中逃逸[5-7]。卵巢癌患者多數一線治療后緩解期短暫，85%患者在化療后復發，而且復發的中位時間不到2年，晚期上皮性卵巢癌的治療迫切需要尋找更為有效的治療手段。

細胞免疫治療以其獨特的優勢越來越廣泛地應用于腫瘤的臨床治療。由于化療藥物的骨髓抑制性，傳統觀念一般認為化療和細胞免疫治療不相容，近年來越來越多研究表明，在循證、規范的綜合治療原則下，這兩者不僅能相容，而且能產生協同抗腫瘤效應。在實體瘤治療中，雖然化療常常引起腫瘤患者中性粒細胞減少癥（neutropenia），但很少發生淋巴細胞減少癥（lymphopenia），這表明化療不削弱免疫效應細胞功能[8]。化療對免疫系統有一些有益的影響，如化療能對髓系來源抑制細胞（myeloid derived suppressor cell，MDSC）以及/或者調節性T細胞（Treg）產生影響；增加腫瘤細胞對凋亡的敏感性或導致腫瘤細胞免疫原性增加，以及調節免疫應答反應等方式增強免疫治療效果[9-10]；同時，免疫治療能夠逆轉腫瘤細胞的化療耐藥性，從而提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性并降低化療的毒性作用等。細胞免疫治療與化療的聯合使用可作為腫瘤治療中一種合理方案[11]。

紫杉醇加鉑類的方案是治療卵巢癌的主要一線化療藥物，主要是通過將細胞阻滯于G2/M期，使癌細胞復制受阻死亡。紫杉醇主要的毒性反應有：過敏、骨髓抑制、神經毒性、胃腸道反應和肝臟毒性等，毒性反應的大小具有劑量相關性。自體CIK細胞輸注是將外周血中的單個核細胞在體外用多種細胞因子共同培養后獲得的一群異質性細胞，其中的主要效應細胞是CD3+CD8+T細胞和CD3+CD56+NK樣T細胞。徐梅等[12]體外實驗發現CIK細胞能誘導卵巢癌SKVO-3細胞的調亡，聯合CIK細胞能明顯增強紫杉醇對SKVO-3細胞的殺傷作用。Liu等[13]研究了上皮性卵巢癌手術及一線化療后CIK細胞的維持治療的療效，與對照組相比，細胞治療延長了患者的無進展生存期，但總生存率未有明顯獲益。

在國內外研究基礎上，筆者采用TC方案化療同步輸注自體CIK細胞的方案治療晚期上皮性卵巢癌患者，最少治療2個周期，17例患者共治療52個周期，輸注156人/次自體CIK細胞，每次細胞數量>109個。可評價病灶的患者中，完全緩解率為11%，部分緩解率為76%，5例有腹水患者在治療后均腹水緩解。17例患者化療后的毒性反應有不同程度的骨髓抑制、脫發、神經毒性和胃腸道反應等。CIK輸注未發生嚴重不良反應，80%患者主訴CIK輸注后，胃腸道反應減輕，精神狀態轉好。杜鴻昱等[14]通過對卵巢癌患者TC方案化療前后T淋巴細胞亞群變化分析發現，化療結束2周后CD3+、CD3+CD4+細胞比例升高，CD3+CD8+細胞比例下調；楊海青等[15]報道卵巢癌患者外周血CD4+CD25+Treg細胞比例明顯偏高。有研究報道，單藥紫杉醇聯合CIK維持化療治療晚期卵巢癌患者后，CD3+、CD4+和NK細胞都有升高趨勢，CD3+CD8+稍有下降[16]。筆者對本組患者治療前后T淋巴細胞亞群分析發現，治療后外周血CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD56+細胞比例較治療前明顯升高（P<0.05），同時CD3+CD4+比例和CD4+CD25+Treg細胞比例下降。

Th1/Th2在腫瘤發生、發展及復發過程中起著十分重要的作用，腫瘤患者的免疫抑制導致Th1反應向Th2的漂移（Th1/Th2漂移），呈Th2類細胞因子強勢表達狀態[17]。最近的一項研究表明，Th1細胞分泌的IFN-γ和TNF-α通過CDKN2A–Rb信號通路對腫瘤細胞造成持久的細胞衰老和生長停滯，說明細胞因子的檢測有一定的意義[18]。卵巢癌患者體內存在免疫應答，一些臨床證據表明，抗腫瘤免疫效應與免疫逃避機制之間的關系預示著更好或者更差的生存率[4]。因此，在對上皮性卵巢癌的綜合治療中化療方案同步輸注CIK細胞，增加患者應急免疫調節以抵消免疫微環境的免疫抑制作用，是有積極意義的。本研究中患者卵巢癌患者經治療后，外周血IFN-γ的水平和其它Th1類細胞因子IL-2、TNF-α的水平也明顯升高。說明CIK治療能部分糾正患者的免疫抑制狀態，改善患者預后。

受患者樣本量和研究時間限制，本組患者未考察無進展生存期和總生存率，在治療中筆者發現，TC方案化療同步輸注自體CIK細胞的晚期卵巢癌患者的腫瘤綜合治療方法，能部分糾正患者的免疫抑制，提高患者Th1類細胞因子水平，有腹水的患者腹水緩解明顯，毒性反應溫和，耐受良好，治療順應性好，具有良好的臨床應用前景。

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