對(duì)金黃色葡萄球菌有拮抗作用的植物乳桿菌的誘變選育

董 菁，薛正蓮，偰德翱，梁 慧

(1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000;2.蕪湖市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽蕪湖 241000)

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)［1－2］屬于乳酸菌中的乳桿菌屬，革蘭氏陽(yáng)性。菌種呈直或彎的桿狀，單個(gè)，有時(shí)成對(duì)或成鏈狀，通常缺乏鞭毛，但能運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)芽孢。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于植物乳桿菌的抑菌活性的研究早有報(bào)道。Abo-Amer［3］從酸奶中分離出的73株乳桿菌中篩選出對(duì)G+和G－細(xì)菌均有一定抑制作用的植物乳桿菌4株;Wilson等［4］對(duì)貯藏溫度為5℃的小蘿卜接種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)SK1進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在貯藏14 d后，與不接種的實(shí)驗(yàn)組比較，單核李斯特菌(Listeria monocyto-genes)的活菌數(shù)下降得更快。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)屬革蘭氏陽(yáng)性菌，是引起食物中毒的主要致病菌之一。該菌在自然界中分布較廣，30% ～80%的人群為該病原菌的攜帶者［5］。近幾年來，我國(guó)由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒已躍居世界第4位［6］。

本文通過測(cè)定植物乳桿菌株對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性能，得到最佳抑菌條件。同時(shí)以該植物乳桿菌為出發(fā)菌株，進(jìn)行ARTP常壓室溫等離子體誘變，希望獲得生長(zhǎng)速率和抑菌效果均有提高的突變株，從而為乳酸菌劑用于食品防腐貯存、飼料添加菌劑開發(fā)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1)實(shí)驗(yàn)菌種

金黃色葡萄球菌ATCC6538，購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心;植物乳桿菌WHLP001，來自本實(shí)驗(yàn)篩查所獲。

2)培養(yǎng)基

MRS 培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 10.0;牛肉粉5.0;酵母粉4.0;葡萄糖5.0;吐溫802.0;磷酸氫二鉀(7H2O)2.0;乙酸鈉(3H2O)5.0;檸檬酸三銨 2.0;硫酸鎂(7H2O)0.2;硫酸錳(4H2O)0.05;瓊脂15.0。

M17 肉湯(g/L):大豆胨 5.0;肉胨 2.5;酪胨2.5;酵母粉 2.5;牛肉浸膏 5.0;乳糖 5.0;抗壞血酸 0.5;甘油磷酸鈉 19.0;硫酸鎂 0.25。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂(g/L):蛋白胨10.0;牛肉粉3.0;氯化鈉 5.0;瓊脂 15.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

XSP-BM系列生物顯微鏡購(gòu)自上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司;SHP-150智能生化培養(yǎng)箱購(gòu)自江蘇光都機(jī)電設(shè)備有限公司;SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;TG-16WS臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;ARTP常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)購(gòu)自北京思清源生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備的菌株取出，并恢復(fù)至室溫后，按10%(V/V)接種量接種于裝有10 mL MRS液體培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，36℃靜置培養(yǎng)24 h;利用1 cm比色皿，在波長(zhǎng)600 nm處，空白選用未加菌株的MRS液體培養(yǎng)基，每隔一定時(shí)間取樣，測(cè)定其吸光度及pH值，并繪制生長(zhǎng)曲線［7］。

1.3.2 牛津杯法測(cè)定抑菌活性

1)發(fā)酵液加入量對(duì)抑菌效果的影響

按照1.3.1節(jié)的步驟對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行培養(yǎng)。采用牛津杯法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵液加入量分別為 50，100，150，200 μL，以考察加入量對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果。

2)擴(kuò)散時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響

發(fā)酵液加入量選用150 μL。將加好發(fā)酵液的平皿放置于4℃的冰箱中靜置擴(kuò)散，擴(kuò)散時(shí)間分別為 0，4，6，8，10，12 h，再置于培養(yǎng)箱中，36℃培養(yǎng)24 h。

1.3.3 ARTP常壓室溫等離子體誘變

1)菌體的培養(yǎng)

活化后的菌體按1%(V/V)接種量接種于裝有10 mL MRS液體培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，36℃靜置培養(yǎng)至菌體生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2)菌懸液的制備

取1)中菌體原液0.5 mL至4.5 mL的 MRS液體培養(yǎng)基中，制成稀釋液，以菌落數(shù)106～107為宜，濃度用 CFU 法確認(rèn)［8］。取 10 μL滴加在菌物載片中心，注意不要流出。

3)ARTP等離子體誘變

常壓低溫等離子誘變育種裝置:供電電源采用220 V，50 Hz市電，電壓波動(dòng)范圍小于等于5%;將高純氦氣(99.99%以上高純氦氣)作為等離子體的工作氣體，入口壓力為0.1～0.2 MPa(表壓)。

為了防止操作室內(nèi)細(xì)菌對(duì)待處理樣品造成影響，在利用育種機(jī)進(jìn)行誘變育種之前需要對(duì)操作室進(jìn)行預(yù)消毒。消毒滅菌15～20 min，氣體流量選用10SLM，溫度40℃以下，選擇照射時(shí)間為0，60，90，120，150，180 s。

4)誘變后的培養(yǎng)及計(jì)數(shù)

將誘變后的樣品載片迅速放入裝有1 mL MRS液體培養(yǎng)基的離心管中，36℃ ±1℃培養(yǎng)2 h后取出。將離心管混勻，取出0.5 mL置于4.5 mL液體培養(yǎng)基中，依次稀釋至 10－1，10－2，10－3，10－4;取10－2，10－3，10－4稀釋倍數(shù)的 3 管菌懸液，用移液槍吸取100 μL，用涂布棒均勻涂布于MRS平板上，每個(gè)稀釋度涂布2塊平板;將涂布后的平板倒置放入培養(yǎng)箱中，36℃ ±1℃培養(yǎng)48 h。

5)存活率的計(jì)算

采用菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算菌落存活率，分別計(jì)算誘變后和未誘變的菌落數(shù)［9］。計(jì)算公式:存活率(%)=(誘變處理后存活的細(xì)胞數(shù)/誘變時(shí)間0 s的菌體存活細(xì)胞數(shù))×100%。

6)正突變株的挑選及遺傳穩(wěn)定性

在最佳誘變條件下，挑取生長(zhǎng)較好的菌株30株，出發(fā)菌株和誘變株在相同條件下培養(yǎng)，測(cè)定OD600值，計(jì)算正突變率、正突變幅度。計(jì)算公式如下［10］:

正突變率(%)=(OD600比出發(fā)菌株提高的菌株數(shù)/測(cè)試的總菌株數(shù))×100%

正突變幅度(%)=(正突變株OD600－出發(fā)菌株的OD600)/出發(fā)菌株OD600×100%

選擇正突變幅度大于15%的菌株作為正突變株，將其連續(xù)8次轉(zhuǎn)接，繼代培養(yǎng)后，測(cè)定 OD600值，觀察穩(wěn)定性。

1.3.4 正突變株的抑菌實(shí)驗(yàn)

采用比濁法測(cè)定正突變株的抑菌活性。當(dāng)光線通過微生物菌懸液時(shí)，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。

1)指示菌菌懸液的制備

活化后的金黃色葡萄球菌菌種，挑取少量加入無(wú)菌生理鹽水中，振蕩試管使菌體分布均勻，與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比對(duì)，配制成0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙簜溆谩Ｔ摼鷳乙簼舛瓤蛇_(dá)107個(gè)/mL。

2)植物乳桿菌發(fā)酵液的制備

將符合6)條中的正突變株(符合條件菌株有4株，編號(hào)為:120s－8，120s－9，120s－16，120s－18)接種于M17肉湯中，于36℃培養(yǎng)48 h后，按10%接種量再次接種于10 mL M17肉湯中以增強(qiáng)菌種的活性。以未誘變的植物乳桿菌株作為空白。

3)植物乳桿菌株上清液的制備

將經(jīng)培養(yǎng)后的植物乳桿菌發(fā)酵液分別放入滅菌離心管中，5000 r/min離心10 min，取上清液備用。

4)抑菌實(shí)驗(yàn)

取若干裝有10 mL M17肉湯的試管，分別編號(hào)為 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，于 10 支試管中分別加入1)中金黃色葡萄球菌菌懸液1 mL;同時(shí)于1，2，3，4號(hào)管中加入正突變的4株植物乳桿菌株上清液2 mL;于5號(hào)試管中加入未經(jīng)誘變的植物乳桿菌上清液 2 mL。培養(yǎng) 24 h 后，于 6，7，8，9，10號(hào)試管中依次加入植物乳桿菌株上清液2 mL。以6號(hào)試管做空白測(cè)定1號(hào)試管溶液在600 nm下的吸光度，以7號(hào)試管做空白測(cè)定2號(hào)試管溶液，依次測(cè)定。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為做平行后取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌的生長(zhǎng)曲線

由圖1可看出:該植物乳桿菌接種后2 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6 h后結(jié)束對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)入穩(wěn)定期，該穩(wěn)定期時(shí)間較長(zhǎng)，可持續(xù)18 h，且OD值基本無(wú)變化。培養(yǎng)基初始pH值為6.5，4 h后達(dá)到5.0，并一直保持，基本無(wú)變化。

圖1 植物乳桿菌的生長(zhǎng)曲線

2.2 發(fā)酵液加入量對(duì)抑菌效果的影響

由圖2可以看出:隨著植物乳桿菌發(fā)酵液加入量的增加，抑菌效果逐漸增強(qiáng);當(dāng)達(dá)到150 μL時(shí)，再增加發(fā)酵液加入量，抑菌效果變化已不明顯。故可確定150 μL為該抑菌實(shí)驗(yàn)的最佳加入量。通過ORGIN軟件對(duì)以上數(shù)據(jù)擬合可得R2=0.9327，Y=5.85X+0.0526，故可判斷發(fā)酵液加入量在50～200 μL時(shí)，抑菌圈直徑和加入量之間有很好的線性相關(guān)。

圖2 發(fā)酵液加入量對(duì)抑菌圈直徑的影響

圖3 不同菌液加入量的抑菌效果

2.3 擴(kuò)散時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響

圖4顯示靜置擴(kuò)散時(shí)間對(duì)抑菌效果有明顯影響，最佳擴(kuò)散時(shí)間為10 h。主要原因是由于150 μL的發(fā)酵液加入量放入冰箱經(jīng)10 h取出后觀察，牛津杯中的發(fā)酵液仍有少量殘留，此時(shí)將平皿進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，牛津杯中的發(fā)酵液會(huì)緩慢滲出，增強(qiáng)抑菌效果。

圖4 擴(kuò)散時(shí)間對(duì)抑菌圈直徑的影響

2.4 ARTP等離子體誘變的致死效應(yīng)

由圖1可知:該植物乳桿菌在接種6 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，且OD值可達(dá)到1.6。為保證誘變時(shí)菌落數(shù)的一致性，選擇穩(wěn)定期菌體細(xì)胞(OD600≥1.6)進(jìn)行誘變。發(fā)現(xiàn)在10－3稀釋倍數(shù)平板上的菌落數(shù)更便于計(jì)數(shù)，故選擇在10－3稀釋倍數(shù)平板上的平均菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)存活率。由表1可知，照射時(shí)間為120 s和150 s時(shí)，致死率可達(dá)到99.01%。

表1 不同誘變時(shí)間與菌落存活率的關(guān)系

2.5 正突變的誘變株的挑選及遺傳穩(wěn)定性

將誘變照射時(shí)間為120、150 s的10－3稀釋倍數(shù)的2塊平板上菌落挑取后接種于MRS液體培養(yǎng)基中(10%接種量)，測(cè)定OD600，發(fā)現(xiàn)誘變照射時(shí)間為120 s的OD600值較高，故確定最佳誘變照射時(shí)間為120 s。在120 s照射時(shí)間下挑選的30株突變株中，其中OD600值增加的菌株有10株，正突變率為 33.33%;編號(hào) 120s－8、120s－9、120s－16、120s－18的突變株的正突變率分別為17.28%，19.01%，19.31%，19.43%(見表 2)。將該4株菌株在MRS液體培養(yǎng)基中傳代8次后，測(cè)定OD600值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OD600值未發(fā)現(xiàn)明顯改變，表明經(jīng)誘變后的菌株產(chǎn)量性狀在傳代過程中基本保持穩(wěn)定。故將該4株菌株保存，以出發(fā)菌株作對(duì)照，利用比濁法測(cè)定該4株菌株對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性能。

2.6 正突變株的抑菌活性的測(cè)定

對(duì)編號(hào)120s－8、120s－9、120s－16、120s－18的突變株進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以出發(fā)菌株作對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn):該4株菌株的發(fā)酵上清液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性均有所增強(qiáng)，編號(hào)120s－18的突變株較出發(fā)菌株的抑菌活性增強(qiáng)的幅度最大，吸光度較空白減少了60.8%，較出發(fā)菌株的抑菌率提高了37.48%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該誘變方法對(duì)植物乳桿菌的抑菌活性的增強(qiáng)效果比較明顯。

3 討論與結(jié)論

植物乳桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌實(shí)驗(yàn)中，通過優(yōu)化發(fā)酵液加入量和擴(kuò)散時(shí)間，得到最佳抑菌條件:發(fā)酵液加入量為150 μL，擴(kuò)散時(shí)間為10 h。用ARTP對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行誘變處理，誘變照射時(shí)間為120 s時(shí)致死率可達(dá)99.01%，此時(shí)的正突變率也最高，可達(dá)33.33%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)有4株菌株的生長(zhǎng)速率和抑菌效果較出發(fā)菌株有較大提高。編號(hào)120s－18的突變株較出發(fā)菌株的抑菌活性增強(qiáng)的幅度最大，吸光度較空白減少了60.8%，而出發(fā)菌株較空白的吸光度只減小了44.2%，且該菌株培養(yǎng)24 h后的OD600值為1.973，相同培養(yǎng)條件下出發(fā)菌株的OD600值為1.652。故可知編號(hào)120s－18的突變株較出發(fā)菌株其生長(zhǎng)速率和抑菌率分別提高了19.43%和37.48%。說明植物乳桿菌在經(jīng)ARTP等離子誘變選育后，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性能不僅未發(fā)生改變，反而增強(qiáng)了。植物乳桿菌發(fā)酵液和上清液的抑菌試驗(yàn)均顯示出較好的抑菌效果，說明植物乳桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物中具有抑菌物質(zhì)。

該研究成功獲得了一株菌體生長(zhǎng)速率和抑菌活性均得到較大提高的植物乳桿菌株。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)常見乳酸菌對(duì)所有腐敗菌的抑制作用建立一個(gè)乳酸菌的抑菌圖譜，這樣就為不同食品可采用何種抗菌物質(zhì)進(jìn)行防腐最有效，以及該種抗菌物質(zhì)可從何種乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物中提取提供了一個(gè)依據(jù)，從而為乳酸菌劑用于食品防腐貯存及飼料添加菌劑開發(fā)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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