通補(bǔ)消積飲對人肺腺癌A549細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響

李義君，劉建秋，全麗娜

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040;3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，哈爾濱 150040）

通補(bǔ)消積飲對人肺腺癌A549細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響

李義君1，劉建秋2，全麗娜3

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040;3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，哈爾濱 150040）

目的 研究通補(bǔ)消積飲對A549細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響，探討通補(bǔ)消積飲治療肺癌的作用機(jī)制。方法 用Western-blot法檢測通補(bǔ)消積飲對A549細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 通補(bǔ)消積飲低、中、高劑量組含藥血清作用于A549細(xì)胞48 h后，PCNA蛋白相對表達(dá)量分別為（0.749±0.083），（0.534±0.052），（0.402±0.048），通補(bǔ)消積飲各劑量組與空白血清組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），并表現(xiàn)出明顯劑量依賴性。結(jié)論 通補(bǔ)消積飲能明顯抑制A549細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)。

通補(bǔ)消積飲;腫瘤;A549細(xì)胞;PCNA蛋白

肺癌常見的病理類型是腺癌，占全部肺癌病人的40%左右［1-3］。目前我國多數(shù)肺癌患者確診時已是中、晚期，失去了手術(shù)治療的機(jī)會，以中醫(yī)藥治療為主結(jié)合姑息性放、化療及靶向治療的綜合性治療在臨床實(shí)踐中日益顯示出其重要性［4］。通補(bǔ)消積飲是針對中晚期非小細(xì)胞肺癌的病機(jī)特點(diǎn)，在多年臨證中總結(jié)的經(jīng)驗方。筆者研究了通補(bǔ)消積飲對A549細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響。總結(jié)報道如下。

1 實(shí)驗材料

1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗動物 實(shí)驗瘤株為人肺腺癌A549細(xì)胞，制備含藥血清動物為Wistar雄性大鼠。

1.2 主要儀器 二氧化碳孵育箱:NO.NU-5500E，美國NUAIR公司。醫(yī)用超凈工作臺:CJ-2F，中國蘇州。高速臺式離心機(jī):5415R，德國EPPENDORF公司。低速離心機(jī):B40，中國河北安新。電熱恒溫水槽:DK-8D，上海一恒科技有限公司。電泳儀:DYY－122，北京六一儀表廠。垂直電泳槽及制膠裝置:美國BioRad公司。酶標(biāo)儀:450，美國伯樂。

1.3 主要藥品與試劑 通補(bǔ)消積飲中藥復(fù)方由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院飲片藥局提供。順鉑:齊魯制藥有限公司。RIPA裂解液:上海碧云天生物試劑有限公司。Bradford法蛋白定量試劑盒:上海美季生物技術(shù)有限公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）:碧云天生物技術(shù)研究所。ECL試劑盒:上海碧云天生物試劑有限公司。Beta Actin antibody、PCNA antibody:Abcam香港公司。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理。組間比較采用t檢驗，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實(shí)驗方法

2.1 含藥血清制備 取Wistar雄性大鼠20只，隨機(jī)分為5組。通補(bǔ)消積飲低、中、高劑量組給藥劑量分別為28，56，112 g/（kg·d），分 2次灌胃;空白血清組:灌生理鹽水，分2次灌胃;順鉑組:正常大鼠血清中加入順鉑制成濃度為2.5 μg/mL含藥血清;連續(xù)給藥5 d，末次給藥前禁食12 h，但不禁水。第5天灌服1 d劑量，2 h后將大鼠麻醉，心臟穿刺采血取含藥血清，過濾除菌，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇后的A549細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，用胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗時取對數(shù)生長期細(xì)胞。

2.3 Western-blot法 檢測通補(bǔ)消積飲對A549細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響。

2.3.1 蛋白的提取 將A549細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入各組血清作用48 h后收集細(xì)胞。將收集的各組細(xì)胞離心，棄上清，EP管標(biāo)記好組別。向各組EP管內(nèi)加入適量細(xì)胞裂解液（RIPA裂解液+PMSF）并充分混勻，再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后離心5 min，取上清。

2.3.2 Bradford法進(jìn)行蛋白定量 取出適量已保存于冰箱的Bradford 2×染色液，將其平衡至室溫，酶標(biāo)儀預(yù)熱20 min。用適量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，加入去離子水，將其從原液5 mg/mL稀釋至1 mg/mL，振蕩混勻后室溫放置。用酶標(biāo)儀測定595 nm處的吸光值，以不含BSA的光吸收值為空白對照。以蛋白含量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測蛋白樣品用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，取10 μL樣品，加入100 μL 2×Bradford染色液和90 μL的去離子水，混勻后放置，測定樣品吸收值A(chǔ)595。根據(jù)測得的吸收值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得樣品的蛋白含量。

2.3.3 Western-blot分析

2.3.3.1 SDS-PAGE電泳 制膠玻璃板垂直裝在制膠架上固定器固定，灌入分離膠于玻璃槽中，上面加少量的去離子水，膠凝固后棄上層水，在分離膠上直接灌入濃縮膠，立即插入樣品梳子，等待膠凝固。在樣品（取50 μg蛋白）中加入2×SDS加樣緩沖液，使蛋白質(zhì)變性、解聚。將凝固后的凝膠放入電泳槽中，加上電泳緩沖液，取出梳子，已處理好的樣品上樣到凝膠樣品孔內(nèi)。上層膠用80 V電壓，當(dāng)樣品至分離膠時，用120 V電壓，溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，一般電泳時間在1.5 h左右。

2.3.3.2 轉(zhuǎn)膜 將凝膠、海綿墊、PVDF膜、濾紙等轉(zhuǎn)膜所用的物品浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中。在電泳轉(zhuǎn)膜裝置的陽極上先放海綿墊，再放3張濾紙，之后放PVDF膜，在PVDF膜上面放凝膠，再放3張濾紙，之后放海綿墊，海綿墊上面是陰極，用玻璃棒排除氣泡后封閉電轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移方向是從負(fù)極轉(zhuǎn)向正極。

2.3.3.3 封閉 將電轉(zhuǎn)移后的PVDF膜水漂洗后放入封閉液中，振搖封閉1 h。

2.3.3.4 孵育抗體 一抗溶液為PCNA抗體和βactin抗體的稀釋溶液，二抗溶液為HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG稀釋溶液。在一抗溶液中放入PVDF膜，4℃振搖孵育2 h，之后用 TBST液洗膜3次，然后將PVDF膜放入二抗溶液中，常溫振搖孵育2 h，之后用TBST液洗膜3次，再換用TBS洗膜2次。

2.3.3.5 顯色 將PVDF膜放入雙蒸水中5min，之后進(jìn)行ECL反應(yīng)，放入暗盒，進(jìn)行X線壓片，進(jìn)行顯影。

2.3.3.6 ImageJ圖像分析 應(yīng)用ImageJ圖像分析軟件對Western-blot圖片進(jìn)行灰度分析和統(tǒng)計學(xué)分析。求得PCNA基因蛋白條帶的灰度值/β-actin基因蛋白灰度值的比值作為PCNA蛋白的相對表達(dá)量。

3 實(shí)驗結(jié)果

從Western-blot圖片以及結(jié)果分析可以看出（見表1，圖1），通補(bǔ)消積飲含藥血清作用于A549細(xì)胞48 h后，PCNA蛋白表達(dá)顯著下降，且隨著通補(bǔ)消積飲劑量的增加，PCNA蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)。各組PCNA蛋白相對表達(dá)量分別為空白血清組（0.893±0.065），通補(bǔ)消積飲低劑量組（0.749±0.083），通補(bǔ)消積飲中劑量組（0.534±0.052），通補(bǔ)消積飲高劑量組（0.402±0.048），順鉑組（0.391±0.057）。通補(bǔ)消積飲各劑量組與空白血清組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），并表現(xiàn)出明顯劑量依賴性。通補(bǔ)消積飲高劑量組與順鉑組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而通補(bǔ)消積飲中、低劑量組與順鉑組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 通補(bǔ)消積飲含藥血清對A549細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響（±s，n=4）

表1 通補(bǔ)消積飲含藥血清對A549細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響（±s，n=4）

注:與空白血清組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與順鉑組比較，△△P＜0.01

組 別 PCNA 蛋白相對表達(dá)量空白血清組 0.893±0.065通補(bǔ)消積飲低劑量組 0.749±0.083#△△通補(bǔ)消積飲中劑量組 0.534±0.052##△△通補(bǔ)消積飲高劑量組 0.402±0.048##順鉑組 0.391±0.057##

圖1 通補(bǔ)消積飲含藥血清作用A549細(xì)胞48 h后PCNA蛋白表達(dá)結(jié)果

4 討論

中醫(yī)學(xué)立足于整體觀治療腫瘤，具有獨(dú)特理念和優(yōu)勢［5］。肺癌是全身性疾病的局部表現(xiàn)，是由正氣內(nèi)虛，邪毒外侵或者內(nèi)生，導(dǎo)致痰、瘀、毒、熱等留滯于肺臟，久羈而不去，凝聚而成［6］。中晚期非小細(xì)胞肺癌的主要證型是氣陰兩虛型。臨床研究［7-8］顯示，從肺癌病例的證型分布上看，氣陰兩虛或陰虛證型占總數(shù)的80%以上。肺癌氣陰兩虛貫穿始終，與肺臟的生理特征有著密切的相關(guān)。

增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，是細(xì)胞DNA合成必不可少的因子，腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖活性，因此檢測PCNA在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，可以作為判斷腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)［9］。很多學(xué)者［10-11］在研究中發(fā)現(xiàn)，PCNA 在肺腺癌細(xì)胞中有過度表達(dá)。

通補(bǔ)消積飲由人參、麥冬、黃芪、北沙參、白術(shù)、薏苡仁、半夏、陳皮、貝母、全瓜蔞、蚤休、白花蛇舌草、半枝蓮、山慈菇、莪術(shù)、大黃、甘草，共17味藥物組成。通補(bǔ)消積飲是針對中晚期非小細(xì)胞肺癌以氣陰兩虛為主，兼痰、瘀、熱毒互結(jié)的病因病機(jī)而擬定的經(jīng)驗方。本實(shí)驗結(jié)果表明，通補(bǔ)消積飲能有效降低A549細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)。通補(bǔ)消積飲對A549細(xì)胞增殖抑制作用的可能機(jī)制是:通補(bǔ)消積飲能有效下調(diào)A549細(xì)胞中PCNA蛋白的表達(dá)，使DNA的合成受阻，從而達(dá)到對A549細(xì)胞的增殖抑制，實(shí)現(xiàn)其治療肺癌的目的。

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Effect of Tongbu Xiaoji Decoction on the expression of PCNA in human lung adenocarcinoma A549 cell

LI Yijun1，LIU Jianqiu2，QUAN Lina3
（1.The Second Hospital Affiliated to Heilongjiang University of TCM，Harbin 150001，China;2.The First Hospital Affiliated to Heilongjiang University of TCM，Harbin 150040，China;3.Cancer Hospital Affiliated to Harbin Medical University，Harbin 150040，China）

Objectives To investigate the influence of the Tongbu Xiaoji Decoction on the human lung adenocarcinoma A549 cells and the expression of PCN，thus to discuss the mechanism of the Tongbu Xiaoji Decoction to lung carcinoma.MethodsThe expression of PCNA protein in A549 cells were evaluated by Western blot.Result Tongbu Xiaoji Decoction with low、median and high dose medicated serum were used to affected A549 cell in 48 h separately.The protein expression of PCNA of A549 cells was significantly decreased and the values were（0.749 ±0.083），（0.534±0.052）and（0.402 ±0.048）.Compared with that of blank group，Tongbu Xiaoji Decoction with low、median and high dose medicated serum had a significant difference（P ＜0.05/P ＜0.01），and the affection shows a dose-dependent manner.Conclusions Tongbu Xiaoji Decoction inhibited the protein expression of PCNA to A549 cells significantly.

Tongbu Xiaoji Decoction;Cancer;A549 Cell;PCNA

R285.5

A

2095－6258（2014）05－0790－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.05.011

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目“通補(bǔ)消積飲對人肺腺癌A549細(xì)胞增殖與凋亡影響的研究”（12521509）。

李義君（1979－），男，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師。研究方向:中醫(yī)藥治療惡性腫瘤的臨床與實(shí)驗研究。

2014－05－20）