綠豆中四種蛋白質的分級提取與功能性質研究

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(天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津市食品生物技術重點實驗室,天津 300134)

綠豆中四種蛋白質的分級提取與功能性質研究

喬寧,張坤生*,任云霞

(天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津市食品生物技術重點實驗室,天津 300134)

采用Osborne方法分級分離了綠豆中的蛋白質,得到四種蛋白組分:清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,并對其進行功能性質評價。對比評價結果表明:溶解度大小為:清蛋白>球蛋白>谷蛋白>醇溶蛋白；四種蛋白組分中,谷蛋白持水與持油能力較好,清蛋白起泡性較好,醇溶蛋白顏色最好、感官接受度較高,四種蛋白組分在堿性條件下均有較好的乳化性,且均在270～280nm處均產生最大吸收峰。

綠豆蛋白,分級提取,功能性質

綠豆,又名青小豆,為豆科一年生草本植物。綠豆是我國傳統藥食兼用的食材,有“食中佳品,濟世長谷”之美稱,在我國已有兩千多年的栽培歷史,其產量和出口量均居世界首位。我國常年種植面積約80萬公頃,總產量保持在近100萬t[1-2]。綠豆中蛋白質含量較高,氨基酸種類豐富,且功能性質優良。近年來,綠豆蛋白的研究集中在綠豆蛋白的粗提及總蛋白功能性質[3-5],而本研究將綠豆蛋白進行分級提取,分別研究綠豆中四種蛋白組分即清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的功能性質,分析比較同等條件下這四種蛋白組分溶解性、起泡性、乳化性等功能特性,并分別對這四種蛋白組分進行全波段掃描,分析其紫外吸收光譜,以期為綠豆中四種蛋白組分在食品工業中更廣闊的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

綠豆 益海嘉里食品營銷有限公司；考馬斯亮藍R-250、三氯乙酸、丙酮、石油醚、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉 均為分析純。

6202高速粉碎機 北京環亞天元機械技術有限公司；FA11004電子天平 上海精天電子儀器有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；BECKMAN Model JZ-Z1 Centrifuge 貝克曼儀器公司；實驗室pH計FE20 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；冷凍干燥機FD-2 北京博醫康實驗儀器有限公司；Hunter Lab色差儀 美國Hunter Lab公司；UV-7504紫外可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；FLUKO Homogenizers 上海弗魯克流體機械制造有限公司；臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；PerkinElmer Lambda 25 UV/VIS 光譜儀。

1.2實驗方法

1.2.1 石油醚脫脂 參照文獻[6]的方法,將原料綠豆除雜后清洗干凈放入烘箱內低溫鼓風烘干,用磨粉機將其磨成綠豆粉,過80目篩備用。用天平稱取一定質量的綠豆粉放入1000mL 圓底三口燒瓶組裝的提取裝置中,按照1∶2的料液比加入石油醚(沸程:30～60℃),于50℃水浴中回流2h,回流結束后,提取裝置冷卻至室溫后用網孔尺寸為0.125mm的尼龍紗布濾去溶劑,換新的石油醚再次回流。如此重復3次。將濾液旋轉蒸發濃縮,回收石油醚,將燒瓶中全部綠豆粉末轉移至平皿中,置于40℃鼓風干燥箱中,干燥后裝入封口袋中備用。

1.2.2 Osborne分級提取工藝 參考文獻[7-8]的方法略作修改,對綠豆中的蛋白質進行分級提取。

清蛋白:取100g脫脂綠豆粉于2L的大燒杯中,加入1000mL去離子水,在室溫條件下攪拌浸提2h,然后8000×g、4℃離心20min,過濾上清液。再加500mL去離子水對沉淀進行再次水提,操作條件與前者相同。合并兩次所得的上清液,冷凍干燥,所得樣品即為清蛋白。

球蛋白:將提取清蛋白后的沉淀用1000mL 1mol/L NaCl進行浸提,在室溫條件下攪拌浸提2h,然后8000×g、4℃離心20min,過濾上清液。再加500mL 1mol/LNaCl對沉淀進行再次浸提,操作條件與前者相同。合并兩次所得的上清液,4℃置于去離子水中透析(MWCO:8000～12000u)72h,其間換水數次,然后離心獲得沉淀,進行冷凍干燥,所得樣品即為球蛋白。

醇溶蛋白:將提取球蛋白后所得的沉淀用1000mL 70%(v/v)的乙醇進行浸提,在室溫條件下攪拌浸提2h,然后8000×g、4℃離心20min,過濾上清液。然后加500mL 70%乙醇對沉淀再次浸提,操作條件與前者相同。合并兩次所得的上清液,旋轉蒸發濃縮后再進行冷凍干燥,所得樣品即為醇溶蛋白。

谷蛋白:將提取醇溶蛋白后所得的沉淀用1000mL 0.05mol/L的NaOH溶液進行浸提,在室溫條件下攪拌浸2h,然后8000×g、4℃離心20min,過濾上清液。然后加500mL 0.05mol/L NaOH溶液對沉淀進行再次浸提,操作條件與前者相同。合并兩次所得的上清液,邊攪拌邊向其中滴加 20%(w/v)的三氯乙酸,至三氯乙酸的最終濃度為5%(w/v),離心后所得沉淀用預冷的丙酮洗滌3次；然后將沉淀進行熱風干燥,所得樣品即為谷蛋白。

1.2.3 功能性質測定

1.2.3.1 持水性與持油性測定 參照文獻[9-11]的方法,稱0.5g蛋白(精確到0.001)和20mL蒸餾水于離心管中混勻,震蕩,靜置20min后,于3000×g下離心30min,測定上清液體積,體積減少量即為樣品吸水量。持水性表示為每克樣品吸附水的體積。

稱取0.5g蛋白(精確到0.001)和10mL大豆油于離心管中混勻,震蕩,室溫靜置20 min,然后8000r/min離心30min,測定上清液體積,體積減少量即為樣品吸油量。持油性表示為每克樣品吸附油的體積。

1.2.3.2 溶解性測定 按照文獻[12]的方法,配制1%的蛋白溶液,在不同的pH(3.0,5.0,7.0,9.0,11.0)和溫度(20、40、60、80、100℃)下攪拌30min,然后3000r/min 離心20min,采用考馬斯亮藍法測定各上清液中的蛋白質濃度,每組實驗均做3次平行。溶解度表示為上清液蛋白質濃度占總蛋白質濃度的比例。

1.2.3.3 起泡性能測定 參照文獻[7,13]的方法,起泡性:配制1%的蛋白溶液,調節至不同的pH(3.0、5.0、7.0、9.0、11.0)經高速分散機以13500rpm攪打2次,每次30s,中間間隔數秒,迅速倒入500mL量筒中,記錄攪拌停止時泡沫及液體的總體積。

式(1)

X:起泡性(%);V:攪拌停止時泡沫及液體的總體積/mL;V0:蛋白溶液攪拌前的體積/mL

泡沫穩定性:靜置上述攪打的樣品,分別記錄經過10、20、30、40、50、60min 后泡沫的殘留體積(Vr)。泡沫穩定性(Foaming Stability,FS)按下式進行計算:

FS(%)=Vr/V0×100

式(2)

1.2.3.4 乳化性能測定 參照文獻[14-15]的方法,配制3%的蛋白溶液20mL,調節至不同的pH(3.0、5.0、7.0、9.0、11.0),在12000r/min 條件下室溫均質30s,加入40mL大豆油,再均質2min,迅速將乳化液倒入100mL的離心管中,2700r/min 離心5min,測量乳化層體積。上述方法所得混合液80℃保溫30min,冷卻至室溫后2700r/min離心5min,取出后測量乳化層體積。計算乳化性(EA)和乳化穩定性(ES)。

乳化性(%)=乳化層體積/液體總體積×100

式(3)

乳化性穩定(%)=30min后的乳化層體積/液體總體積×100

式(4)

1.2.4 色差分析 按照文獻[7]的方法,采用色差分析儀進行色差分析,核對標準白板,將待測樣品放在探測器端面,每個樣品測3次。L稱為明度指數,L=0表示黑色,L=100表示白色,L值越大亮度越大；a值從負到正表示從綠到紅,正值越大偏向紅色的程度越大,負值越大偏向綠色的程度越大；b值從負到正表示從藍到黃,正值越大偏向黃色的程度越大,負值越大偏向藍色的程度越大。

1.2.5 紫外吸收光譜的測定 將四種蛋白組分分別用相應的緩沖溶液配成1.0mg/mL的蛋白質溶液,以一定的比例稀釋后,以相應的緩沖溶液為參比,進行紫外-可見光掃描,掃描范圍是250～500nm,掃描速度10nm/min。

1.2.6 數據處理 采用spss16.0對數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1各蛋白組分的含量

采用Osborne法提取的清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白占總蛋白的含量如圖1所示。提取出的綠豆蛋白中清蛋白含量最多,占提取蛋白總量的49.60%,球蛋白、谷蛋白次之,分別占23.58%和19.42%,醇溶蛋白含量最少,只有7.47%。Osborne法是常用的蛋白質分級分離方法,是根據不同蛋白組分在不同溶劑中的溶解性不同而進行分離,該法較為粗略,考慮到實驗原料和提取條件的影響,所得實驗結果可能會存在一定誤差。

圖1 綠豆中各蛋白組分的百分含量Fig.1 Contents of albumin,globulin,gliadin and glutenin in total proteins of mung bean

2.2綠豆蛋白的持水性與持油性

圖2所示為綠豆中各蛋白組分的持水與持油能力。谷蛋白的持水能力遠高于其他三種蛋白質。該實驗結果與管驍[16]等人的研究結果相類似。一般而言,蛋白質的溶解性越好,其持水能力越差[17]。清蛋白的持水性也較好,可能是與其中的大分子糖類有關。研究表明物理截留作用對蛋白質的持油能力有最主要的貢獻[18]。谷蛋白的容積密度較小,持油能力較好(5.53mL/g),其次是清蛋白,球蛋白和醇溶蛋白的持油性較差。

圖2 綠豆中各蛋白組分的持水、持油性Fig.2 Water-holding and oil-holding capacities of mung bean protein fractions

2.3綠豆蛋白的溶解性

2.3.1 綠豆蛋白在不同pH下的溶解性 圖3所示為綠豆中各蛋白組分在不同pH下的溶解性曲線。從圖3可以看出,在同一pH下,四種蛋白組分的溶解度大小依次為:清蛋白>球蛋白>谷蛋白>醇溶蛋白。其中,清蛋白的溶解性受pH的影響較小,基本維持在65%左右,其他三種蛋白質的溶解性隨著pH的增加呈現先減小后增加的趨勢。球蛋白在pH5.0左右溶解性最低,在較高或較低的pH下溶解性均明顯增加。谷蛋白和醇溶蛋白的溶解性較差,在堿性條件下的溶解性優于酸性條件。

圖3 綠豆中各蛋白組分的 pH-NSI 曲線Fig.3 pH-NSI curves of mung bean protein fractions

2.3.2 綠豆蛋白在不同溫度下的溶解性 圖4所示為綠豆中各蛋白組分在不同溫度下的溶解性曲線。從圖中可以看出,溫度對四種蛋白組分的溶解度影響較大,隨著溫度的增高,四種蛋白組分的溶解度均呈現先增加后降低的趨勢,該趨勢與劉冬兒等所研究的綠豆分離蛋白受溫度的影響規律相同[4]。產生這種現象可能是由于適量的升溫有利于蛋白質分子的溶解,而過高的溫度會使蛋白質發生熱變性,從而使溶解度降低。其中,清蛋白的溶解度最大,明顯優于其他三種蛋白質,可能由于清蛋白是水溶性蛋白,而其他三種蛋白質受溶液中離子強度及pH等因素的影響,溶解度較低。

圖4 溫度對綠豆中各蛋白組分的溶解性的影響Fig.4 Effect of temperature on the solubility of mung bean protein fractions

2.4綠豆蛋白的起泡性能

表1 綠豆蛋白各組分的泡沫穩定性Table 1 Foaming stability of mung bean protein fractions

圖5 pH對綠豆中各蛋白組分的起泡性的影響Fig.5 Effect of pH on the foaming capacity of mung bean protein fractions

圖6 pH對綠豆中各蛋白組分的乳化活性和乳化穩定性的影響Fig.6 Effect of pH on emulsifying activity and stability of mung bean protein fractions

圖5和表1所示為綠豆中各蛋白組分的起泡性和泡沫穩定性。由以上圖表可知,pH對四種蛋白組分的起泡性能影響較大。清蛋白具有較好的起泡性,球蛋白次之,醇溶蛋白和谷蛋白的起泡性較差。而谷蛋白卻具有優良的泡沫穩定性,明顯優于其他三種蛋白質。隨著pH的增加,四種蛋白質的起泡性均呈現增加的趨勢。在pH5.0左右,四種蛋白質的起泡性最差,這可能是由于pH5.0接近蛋白質的等電點,此時蛋白的溶解性較差。四種蛋白在酸性和堿性條件下的起泡性較好,這是由于蛋白分子在酸性或堿性條件下帶凈正電荷或凈負電荷,使分子間靜電斥力增加有利于其更快地吸附至氣液界面,從而使蛋白質的起泡性增加。

2.5綠豆蛋白的乳化性能

圖6所示為綠豆各蛋白組分在不同pH下的乳化性和乳化穩定性。由圖6可知,清蛋白在pH接近7.0時,乳化性最低,在酸性和堿性條件下乳化性均增強。球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白在pH5.0左右乳化性最低,pH大于5.0時,隨著pH的增加乳化性逐漸增強,這種變化規律與球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白的溶解性曲線相吻合。這是由于不溶性的蛋白質對乳化性貢獻很小,蛋白質須先溶解并移動到表面才能對表面性質起作用。這四種蛋白質在乳化性最差的pH條件下,擁有較好的乳化穩定性,明顯優于堿性條件下的乳化穩定性。

2.6綠豆蛋白的色度值

表2中比較了制備的綠豆中四種不同的蛋白組分的顏色差別。醇溶蛋白亮度最高,黃度最低,顏色最好,感官接受度最高。其次是清蛋白和球蛋白,其中清蛋白的亮度較高,黃度也較小,這兩種蛋白也有較好的感官接受度。球蛋白亮度較低,且黃度也較高,顏色較差,感官接受度最低。

2.7綠豆蛋白的紫外吸收光譜

圖7所示為綠豆中各蛋白組分的紫外吸收光譜。由圖7可知,在270～280nm附近,四種蛋白質均出現最大吸收峰,這是由于芳香族氨基酸中酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)的紫外吸收作用,他們的最大吸收波長分別為:Tyr275nm,Trp280nm,Phe257nm。清蛋白的吸收峰在265nm處,吸光光度值為0.749,蛋白含量最大。其次為球蛋白,吸收峰在275nm處,峰值為0.590。谷蛋白和醇溶蛋白的峰值較低,分別在275、270nm出現最大吸收峰。

表2 綠豆中4種蛋白組分的色度值比較Table 2 Color characteristics of mung bean protein fractions

圖7 綠豆中各蛋白組分的紫外吸收光譜Fig.7 The UV-vis spectra of mung bean protein fractions

3 結論

綠豆的蛋白組分中清蛋白和球蛋白含量較高,占綠豆蛋白總量的比例依次為:清蛋白49.60%,球蛋白23.58%。綠豆中四種蛋白組分的功能性質差異較大,其中清蛋白溶解性和起泡性較好,谷蛋白的持水

與持油能力較好,醇溶蛋白顏色最好。在實際應用中,可根據具體的需要來選擇。

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Extraction and Functional Properties of Four Proteins from Mung Bean

QIAONing,ZHANGKun-sheng*,RENYun-xia

(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology,College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China)

Four protein isolates including albumin,globulin,gliadin and glutenin were extracted from mung bean using the Osbron method and their functional properties were evaluated. Comparative evaluation of functional properties showed that the order of solubility of mung bean protein fractions was as follows:albumin>globulin>glutenin>gliadin. The protein possessed the highest water-holding and oil-holding capacities was glutenin. The protein possessed the highest foaming capacity was albumin. The color and sensory acceptance of gliadin were proved to be the best. The mung bean protein fractions all had better emulsifying activity at basic conditions and the maximum absorption peaks at 270～280nm.

mung bean protein;extraction；functional properties

2013-12-16 *通訊聯系人

喬寧(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工與貯藏。

國家科技支撐計劃項目(2012BAD37B06-07)。

TS

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001