豬肺管硫酸軟骨素的提取分離與抗氧化活性研究

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(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽 621010；2.西南科技大學(xué)食品科學(xué)研究所,四川綿陽 621010)

豬肺管硫酸軟骨素的提取分離與抗氧化活性研究

熊雙麗1,2,李安林1,張曉娟1

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽 621010；2.西南科技大學(xué)食品科學(xué)研究所,四川綿陽 621010)

首先比較稀堿、全酶和稀堿-酶法結(jié)合提取豬肺管硫酸軟骨素的工藝,探究豬肺管硫酸軟骨素的最大得率,再采用乙醇沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析和Sephadex G-75分離純化得到高純度硫酸軟骨素,然后采用紫外光譜、紅外光譜和核磁共振技術(shù)對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,最后探討其抗氧化活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),全酶法提取硫酸軟骨素得率最高,得率為4.86g/100g濕軟骨。純化后,97%純度的硫酸軟骨素得率28g/100g粗品。光譜、核磁共振和抗氧化數(shù)據(jù)顯示,該硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)與雞胸軟骨和豬喉軟骨硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)和抗氧化活性相似。因此,豬肺氣管軟骨可以作為硫酸軟骨素的優(yōu)質(zhì)大宗提取資源。

豬肺,硫酸軟骨素,分離,鑒定,抗氧化活性

肉類加工業(yè)是“十二五”時期我國食品工業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)行業(yè)。2013年全球豬肉產(chǎn)量將增長270萬t,達(dá)創(chuàng)紀(jì)錄的1.074億t,中國豬肉產(chǎn)量將達(dá)創(chuàng)紀(jì)錄的5380萬t。按豬肺占1%的比例計算,僅中國來源豬肺可達(dá)54萬t。資源比較豐富。目前對豬肺的利用主要作為普通食物和飼料添加劑,也有關(guān)于其肝素鈉、膠原蛋白、肽、表面活性物質(zhì)提取利用的研究報道[1-4],但都未涉及豬肺管的利用,造成豬肺管的資源浪費(fèi)和廢棄后的環(huán)境污染。利用畜禽加工中副產(chǎn)物(廢棄物),研究其綜合利用技術(shù),進(jìn)行資源化利用,屬于《國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要(2006～2020年)》中重點(diǎn)領(lǐng)域環(huán)境內(nèi)容中的優(yōu)先主題。在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn),豬肺管含有硫酸軟骨素。本論文重點(diǎn)研究硫酸軟骨素的提取分離工藝和主要抗氧化活性,為豬肺的綜合利用奠定良好的理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

豬肺管 綿陽屠宰場；堿性蛋白酶(≥250μ/mg),木瓜蛋白酶(≥1000μ/mg)和胰蛋白酶(≥250μ/mg)北京博潤萊特科技有限公司；DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換劑和Sephadex G-75 Phamacia公司；三氯乙酸 皆為分析純；硫酸軟骨素A,葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品,乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、間羥基聯(lián)苯 Sigma公司；水楊酸、過氧化氫、鄰苯三酚等 皆為分析純；雞胸軟骨和豬喉硫酸軟骨素 均為實(shí)驗(yàn)室純化產(chǎn)品,純度98%。

紫外可見分光光度計(UV-5800) 上海元析儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,SHB-IIS循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；MODULYOD冷凍真空干燥機(jī) 美國Thermo Electron公司；Waters2410型高效液相色譜儀 美國Waters公司；紅外光譜儀Nicolet-5700 美國尼高力儀器公司；DPX 400 Bruker核磁共振儀 德國布魯克公司。

1.2豬肺管硫酸軟骨素提取工藝

1.2.1 稀堿工藝 20g軟骨粉末→300mL 3%(2%、4%)氫氧化鈉,35℃反應(yīng)11h→2mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH為2.35,攪拌10min,靜止2h后離心(4800r/min,15min)→1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為6.5,50℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮至一定體積后加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀過夜(4℃)→離心收集沉淀,55℃干燥后分別得樣品1(3%氫氧化鈉)、樣品2(2%氫氧化鈉)和和樣品3(4%氫氧化鈉)。

1.2.2 全酶酶解工藝 20g軟骨粉末→300mL去離子水,用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH為8.80,加入0.05g堿性蛋白酶和0.05g胰蛋白酶,50℃反應(yīng)4h→調(diào)節(jié)pH為6.5,加入0.03g木瓜蛋白酶,繼續(xù)反應(yīng)4h,→1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH為2.35,攪拌10min,靜止2h后離心(4800r/min,15min)→1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為6.5,50℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮至一定體積后加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀過夜(4℃)→離心收集沉淀,55℃干燥得樣品4?？紤]到酶添加量的影響,在此基礎(chǔ)上,加大酶量(0.06g堿性蛋白酶和0.06g胰蛋白酶,0.06g木瓜蛋白酶),減少酶量(0.03g堿性蛋白酶和0.03g胰蛋白酶,0.02g木瓜蛋白酶)進(jìn)行全酶酶解實(shí)驗(yàn),分別得到樣品5和樣品6。

1.2.3 稀堿-酶解工藝 20g軟骨粉末→300mL 3%氫氧化鈉,35℃反應(yīng)4h→2mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH為9.45,加入0.05g堿性蛋白酶和0.05g胰蛋白酶,50℃反應(yīng)4h→1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH為2.35,攪拌10min,靜止2h后離心(4800r/min,15min)→1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為6.5,50℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮至一定體積后加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀過夜(4℃)→離心收集沉淀,55℃干燥得樣品7。

豬肺硫酸軟骨素得率(%)=硫酸軟骨素產(chǎn)品質(zhì)量/20×100

1.3豬肺管硫酸軟骨素的分離純化

按照最佳提取工藝,得到干燥后的硫酸軟骨素粗品,然后采用DEAE-sepharose Fast Flow離子交換柱層析[5]和Sephadex G-75[5]進(jìn)行分級分離和精細(xì)純化,得到高純度硫酸軟骨素。

1.4硫酸軟骨素的主要成分分析

硫酸根含量、己糖醛酸、氨基己糖分析參照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行。

1.5硫酸軟骨素的紫外和紅外光譜分析[5]

取純化后的多糖,配制成0.5mg/mL的溶液,于200～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。取1mg左右的多糖樣品,與溴化鉀研磨均勻,壓片,于400～4000cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.6硫酸軟骨素的核磁共振分析

[6]進(jìn)行。

1.7硫酸軟骨素的羥基自由基清除活性和超氧陰離子自由基清除活性

羥基自由基清除活性采用Fenton-水楊酸體系,并計算半數(shù)抑制濃度(自由基清除率為50%時樣品的濃度)[7-9]。超氧陰離子自由基清除活性采用鄰苯三酚法,并以濃度為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo),通過Origin 7.5求回歸方程,計算半數(shù)抑制濃度。

1.8統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均為3次平均值,采用SPSS v19.0軟件單因素ANOVA進(jìn)行方差分析,LSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1豬肺管硫酸軟骨素的提取工藝分析

從表1中可以看出,酶解工藝提取硫酸軟骨素得率最高,稀堿工藝最低,稀堿酶解工藝居中。酶解工藝和稀堿-酶解工藝提取硫酸軟骨素得率都極顯著高于堿法(p<0.01)。硫酸軟骨素得率隨稀堿濃度的增加而顯著升高,但超過4%以后,得率不再增加,己糖醛酸和還原糖含量不隨堿濃度升高而顯著變化。考慮到堿濃度增加以后,得率沒有顯著增加,而產(chǎn)品顏色卻顯著加深,因此在稀堿酶解工藝中選擇堿濃度為3%。酶解工藝結(jié)果顯示,硫酸軟骨素得率隨酶濃度增加而顯著升高,但是酶濃度升高以后,己糖醛酸含量也顯著降低,導(dǎo)致硫酸軟骨素含量降低,尤其是木瓜蛋白酶濃度顯著增加以后,己糖醛酸和硫酸軟骨素含量顯著降低。加之酶濃度增加以后,經(jīng)濟(jì)成本也顯著增加,因此采用4號樣品酶濃度進(jìn)行稀堿酶解工藝提取硫酸軟骨素。稀堿酶解工藝中硫酸軟骨素得率與低濃度酶解工藝相似,但還原糖含量顯著高于全酶解工藝,與稀堿工藝相當(dāng),說明稀堿會導(dǎo)致硫酸軟骨素分子的降解,影響分子的結(jié)構(gòu)與活性。三種工藝提取的硫酸軟骨素蛋白質(zhì)含量差異不顯著。綜合考慮,采用全酶解工藝(0.05g堿性蛋白酶和0.05g胰蛋白酶,0.03g木瓜蛋白酶))提取豬肺硫酸軟骨素,產(chǎn)品得率為22.10%,己糖醛酸含量為17.40%。

表1 不同工藝提取硫酸軟骨素得率及主要成分比較Table 1 Yields and components comparision of chondroitin sulfate by different extracting technology

注:同列不同大寫字母的上標(biāo)數(shù)字表示差異極顯著(p<0.01),不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),相同字母表示差異不顯著。

2.2硫酸軟骨素的色譜分離與純度分析

硫酸軟骨素乙醇沉淀粗品采用DEAE Sepharose Fast Flow 離子交換柱層析分離后得到4種多糖級分(圖1),其中采用甲苯胺藍(lán)和己糖醛酸測定,發(fā)現(xiàn)D級分為硫酸軟骨素,將其采用Sephadex G-75凝膠柱層析精細(xì)純化得到高純度硫酸軟骨素。圖2顯示,該峰對稱性好,純度97%,得率28g/100g粗品,成分均一,重均分子量為42412Da?；瘜W(xué)分析發(fā)現(xiàn)該硫酸軟骨素葡萄糖醛酸、氨基己糖和總硫酸根含量分別為32.06%、31.75%和11.97%。

圖1 硫酸軟骨素的DEAE-Sepharose FF洗脫分離曲線Fig.1 Elution pattern of chondroitin sulfate on DEAE-Sepharose Fast Flow

圖2 硫酸軟骨素的高效凝膠色譜Fig.2 HPGPC of chondroitin sulfate

2.3硫酸軟骨素的紫外和紅外光譜

紫外光譜圖3顯示280nm和260nm處無明顯吸收峰,說明無蛋白質(zhì)和核酸存在。紅外光譜圖4中看出,1420～1375cm-1處有C-O伸縮振動和O-H變角振動耦合產(chǎn)生的2個吸收峰,說明存在糖醛酸的游離羧基結(jié)構(gòu)。1256.35cm-1處強(qiáng)吸收為S=O伸縮振動。927.61cm-1及8562.71cm-1處的吸收說明豬肺硫酸軟骨素為4硫酸化硫酸軟骨素[10],與雞胸、豬喉和牛鼻軟骨中硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)相似。

圖3 硫酸軟骨素的紫外光譜Fig.3 Ultraviolet spectrum of chondroitin sulfate

圖4 硫酸軟骨素的分紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of chondroitin sulfate

2.4硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)的NMR分析

1H-NMR圖譜(圖5)顯示,硫酸軟骨素所有質(zhì)子信號出現(xiàn)在1.96～1.94ppm和3～5ppm區(qū)域,與Mucciad等[9]報道的結(jié)果一致。13C-NMR圖譜進(jìn)一步顯示,δ103.79是4硫酸化軟骨素中GlcA的異頭碳信號,δ101.99是4硫酸化軟骨素中GalNAc的異頭碳信號,δ 22.56處的信號峰是乙酰基的甲基碳信號[6,9-10],進(jìn)一步豬肺管硫酸軟骨素為4硫酸化硫酸軟骨素,與雞胸和豬喉軟骨硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)相似。

圖5 硫酸軟骨素的1H-NMR圖譜Fig.5 1H NMR spectrum of chondroitin sulfate

圖6 硫酸軟骨素的13C-NMR圖譜Fig.6 13C-NMR spectrum of chondroitin

2.5豬肺軟骨硫酸軟骨素的自由基清除活性

生命活動氧化代謝過程中不斷產(chǎn)生各種自由基,其中超氧陰離子自由基形成最早,羥基自由基作用最強(qiáng),兩者經(jīng)常被用于篩選、評價具有清除自由基能力的功能性食品和生化藥品。圖7顯示,豬肺管硫酸軟骨素的羥基自由基清除活性和超氧陰離子自由基清除活性都比較高,半數(shù)抑制濃度分別為8.77和0.94mg/mL,與雞胸軟骨和豬喉軟骨硫酸軟骨素差異不顯著,它們分別為8.99，1.11,9.07和0.87mg/mL,超氧陰離子自由基清除活性高于羥基自由基清除活性。因此,豬肺管硫酸軟骨素也可以作為預(yù)防關(guān)節(jié)炎、調(diào)節(jié)血脂和預(yù)防動脈粥樣硬化的商品硫酸軟骨素進(jìn)行深度開發(fā)。

圖7 豬肺軟骨硫酸軟骨素的自由基清除活性Fig.7 Free radical scavenging activity of chondroitin sulfate

3 結(jié)論

豬肺管含有豐富的硫酸軟骨素,可采用全酶法提取硫酸軟骨素,得率為4.86g/100g濕軟骨,該粗品

中硫酸軟骨素含量為62.68%。DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析和 Sephadex G-75分離純化可用來對其進(jìn)行精細(xì)純化,產(chǎn)品純度達(dá)97%以上。該硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)和抗氧化活性與雞胸軟骨/豬喉軟骨硫酸軟骨素一致,可作為硫酸軟骨素提取的的重要來源,同時也可以提高豬肺的綜合利用效益,延伸農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的產(chǎn)業(yè)鏈,降低環(huán)境污染。

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Purification and antioxidant activity of chondroitin sulfate from pig lung trachea

XIONGShuang-li1,2,LIAn-lin1,ZHANGXiao-juan1

(1. School of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China;2. Institute of Food Science,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China)

This article firstly explored yields of chondroitin sulfate from pig lung trachea by comparing low concentration of sodium hydroxide extracting technology,enzymatic hydrolysis technology and low concentration of sodium hydroxide-enzymatic hydrolysis hybrid technology,then isolated and purified it by ethanol precipitation,DEAE-Sepharose Fast Flow anion exchange column chromatograph and Sephadex G-75gel column chromatograph. At last,structure and antioxidant of purified chondroitin sulfate was investigated by ultraviolet spectrum,infra-red spectrum,nuclear magnetic resonance and free radical scavenging activity. The results exhibited that enzymatic hydrolysis technology was the best and the yield of chondroitin sulfate was 4.86g/100g wet trachea. 28g chondroitin sulfate with 97% purify was obtained from 100g crude product. The data of spectral analysis and antioxidant capability of chondroitin sulfate showed that its structure and antioxidant activity was similar to chondroitin sulfate from chicken keel cartilage and pig laryngeal cartilage. Thus,pig lung trachea can be used as good resource of chondroitin sulfate.

Pig lung;chondroitin sulfate;separation;identification;antioxidant activity

2013-01-09

熊雙麗(1977-),女,博士,教授,研究方向:碳水化合物與生物技術(shù)。

四川省科技廳項(xiàng)目(11ZS2013)。

TS201.1

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001