庫拉索蘆薈凝膠多糖脫蛋白方法研究

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(海南大學,材料與化工學院,海南海口 570228)

庫拉索蘆薈凝膠多糖脫蛋白方法研究

何沂飛,劉平懷*,黃良果,陳巧靈,孫玉婉

(海南大學,材料與化工學院,海南海口 570228)

為研究庫拉索蘆薈凝膠多糖蛋白質(zhì)的脫除工藝條件,本文以蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率為指標,比較三氯乙酸(TCA)法、Sevag法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法、木瓜蛋白酶-Sevag聯(lián)用法脫除蘆薈凝膠多糖蛋白的效果。結(jié)果顯示,木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法效果最好,其條件為酶用量2%、酶解溫度60℃、酶解時間1h、pH為6,采用5%TCA除蛋白1次,此時蛋白質(zhì)去除率為83.4%,多糖保留率為74.9%。不同脫蛋白法對蘆薈凝膠多糖的脫蛋白效果有較明顯差異,木瓜蛋白酶-TCA 聯(lián)用法是一種有效的蘆薈凝膠多糖脫蛋白方法。

庫拉索蘆薈,凝膠多糖,脫蛋白

蘆薈屬(Aloe)通稱蘆薈,原產(chǎn)于地中海、非洲,為百合科多年生草本植物,據(jù)考證的野生蘆薈品種有300多種,主要分布于非洲等地。其味苦性寒,具有消炎抗菌的作用[1-3],常用于治療頭痛、肝熱、便秘、膽道結(jié)石、濕癬等。蘆薈多糖是蘆薈主要的生物活性組分之一,研究發(fā)現(xiàn),蘆薈多糖對人體有較強的生理活性,具有廣譜免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗輻射、抗艾滋病病毒、抗?jié)儭⒆o膚美容等多種功效[4-7]。游離蛋白質(zhì)是蘆薈凝膠多糖提取分離過程中主要的雜質(zhì),其存在會使多糖吸濕性增加,且由于蛋白帶有電荷會吸附大量其它雜質(zhì),影響多糖結(jié)構和生物活性,可能導致藥理作用下降[8-9]。基于不同脫蛋白法的特點,本研究分別采用三氯乙酸(TCA)法、Sevag法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法、木瓜蛋白酶-Sevag聯(lián)用法進行脫蛋白研究,考察脫蛋白工藝,以確定適于庫拉索蘆薈(Aloevero)凝膠多糖脫蛋白的方法,為進一步分離純化蘆薈凝膠多糖提供一定參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

庫拉索蘆薈凝膠粗多糖 25%,實驗室自制[10]；D-甘露糖 阿拉丁,AR；木瓜蛋白酶 生工生物,比活性>3500U/mg；牛血清蛋白 美國Sigma公司；考馬斯亮藍G-250 美國Amresco公司；透析袋 美國MYM,截留分子量3.5KDa；蒽酮、濃硫酸(98%)、無水乙醇、丙酮、乙醚等 廣試,AR。

TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；himac CR22 GⅡ高速離心機 日本HITACHI公司；LGJ-25C冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；INFORS AG CH-1403 Bottmingen恒溫搖床 瑞士INFORS公司；BT 224S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 脫蛋白實驗

1.2.1.1 三氯乙酸(TCA)法脫蛋白 將0.5g粗多糖溶于50mL水中,得1g/100mL糖液,取50mL于250mL錐形瓶中,分別加入3%、4%、5%、6%和7%的等體積的三氯乙酸溶液,搖床振蕩30min,靜置過夜,8000r/min離心10min,棄去不溶物。確定最優(yōu)TCA體積分數(shù)后,分別以該體積分數(shù)的TCA進行脫蛋白實驗數(shù)次,考察脫蛋白次數(shù)的效果。

1.2.1.2 Sevag法[11]脫蛋白 取1g/100mL糖液50mL于250mL錐形瓶中,加入0.2倍體積的氯仿和0.04倍體積的正丁醇,搖床震蕩30min,8000r/min離心10min,棄去不溶物。重復操作數(shù)次,測定蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率。

1.2.1.3 木瓜蛋白酶法脫蛋白 取1g/100mL糖液50mL于250mL錐形瓶中,加入木瓜蛋白酶進行酶解。根據(jù)酶法脫蛋白的工藝要求,選取酶用量、酶解時間、酶解溫度、pH為考察因素,以蛋白脫除率和多糖保留率為指標,設計L9(34)正交實驗,采用綜合加權評分法優(yōu)選酶法脫蛋白的工藝條件,權重系數(shù)各為0.5。因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平設計Table 1 Factors and levels for orthogonal test

1.2.1.4 木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法脫蛋白 取1g/100mL糖液50mL,按酶法最佳工藝與TCA法結(jié)合對蘆薈凝膠多糖脫蛋白,測定蛋白脫除率和多糖保留率。

1.2.1.5 木瓜蛋白酶-Sevag聯(lián)用法脫蛋白 取1g/100mL糖液50mL,按酶法最佳工藝與Sevag法結(jié)合對蘆薈凝膠多糖脫蛋白,測定蛋白脫除率和多糖保留率。

1.2.2 蛋白質(zhì)及多糖含量的測定 蘆薈多糖經(jīng)脫蛋白處理后,糖溶液置于透析袋中,循環(huán)水透析48h,真空冷凍干燥,得精制蘆薈多糖。

1.2.2.1 蛋白質(zhì)含量的測定 以考馬斯亮藍染色法測定蛋白質(zhì)含量[12]。用牛血清蛋白溶液做標準曲線,在595nm處測定吸光度,得牛血清蛋白濃度C1與吸光度A1之間的回歸方程。

1.2.2.2 多糖含量的測定 以硫酸-蒽酮法測定多糖含量[12]。用甘露糖溶液做標準曲線,在610nm處測定吸光度,得甘露糖濃度C2與吸光度A2之間的回歸方程。

1.2.3 蛋白質(zhì)脫除率、多糖保留率和綜合評分的計算

式中,R1為除蛋白前粗多糖中蛋白質(zhì)質(zhì)量/g,R2為除蛋白后粗多糖中蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；P1為除蛋白前粗多糖中多糖質(zhì)量/g,P2為除蛋白后粗糖中多糖質(zhì)量/g；Xmax為蛋白脫除率最大值,Ymax為多糖保留率最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1蛋白質(zhì)及多糖含量標準曲線方程

以牛血清蛋白濃度C1為橫坐標,吸光度A1為縱坐標,得蛋白質(zhì)含量測定的線性回歸方程A1=0.0061C1+0.0047(R2=0.9982),線性范圍為60～140μg/mL。

以甘露糖濃度C2為橫坐標,吸光度A2為縱坐標,得多糖含量測定的線性回歸方程A2=5.3891C2+0.0023,(R2=0.9987),線性范圍為40～90μg/mL。

2.2三氯乙酸(TCA)法脫蛋白結(jié)果

由圖1可知,隨著TCA體積分數(shù)的增加,蛋白質(zhì)的脫除率逐漸增大,多糖保留率逐漸降低,綜合蛋白脫除率和多糖保留率分析,確定TCA體積分數(shù)為5%時脫蛋白效果最佳,其脫除率為62.1%,多糖保留率為81.1%。由圖2可以看出,在TCA體積分數(shù)為5%時,蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率均隨脫蛋白次數(shù)的增加而增大,綜合分析,最優(yōu)效果為脫蛋白3次,蛋白去除率達69.7%,多糖保留率71.1%。

圖1 不同TCA體積分數(shù)的脫蛋白效果Fig.1 Effect of different TCA concentration on deproteinization

圖2 不同TCA使用次數(shù)的脫蛋白效果Fig.2 Effect of different TCA numbers on deproteinization

2.3 Sevag法脫蛋白結(jié)果

由圖3可知,Sevag法除蛋白1次時,蛋白脫除率為9.8%,多糖保留率為96.5%。隨著脫蛋白次數(shù)的增加,蛋白脫除率有所增加,但5次脫蛋白后脫除率僅為35.5%,同時多糖保留率也降低到78.3%,仍有大量的蛋白未被除去。

圖3 不同Sevag法使用次數(shù)的脫蛋白效果Fig.3 Effect of different Sevag numbers on deproteinization

2.4木瓜蛋白酶法脫蛋白結(jié)果

以木瓜蛋白酶法脫蛋白的正交實驗結(jié)果見表2。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal design

表2實驗結(jié)果表明,木瓜蛋白酶法脫蛋白工藝條件的最佳組合為A2B2C2D2,即酶用量2%,酶解溫度60℃,酶解時間1h,pH為6。根據(jù)極差分析,影響木瓜蛋白酶脫蛋白效果的因素大小為:酶用量(A)>酶解時間(B)>pH(D)>酶解溫度(C)。

表3 正交實驗結(jié)果方差分析表Table 3 Variance analysis table of orthogonal experiment results

注:*表示差異顯著；-表示差異不顯著。

以極差較小的C、D因素為誤差項,對表2的實驗結(jié)果進行方差分析和F檢驗,結(jié)果見表3。F檢驗結(jié)果表明,酶用量(A)和酶解時間(B)兩個因素各水平存在顯著性差異,而酶解溫度(C)和pH(D)的影響不顯著。

在最佳工藝條件下進行驗證實驗3次,蛋白脫除率為64.2%±0.5%,多糖保留率為82.3%±0.7%。

2.5木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法脫蛋白結(jié)果

由圖4可知,使用酶法優(yōu)化后,脫蛋白率可達64.2%,多糖保留率可達82.3%。接著使用TCA法除蛋白,處理1次后蛋白脫除率和多糖保留率分別為83.4%和74.9%,綜合加權評分為1.104,優(yōu)于正交實驗中結(jié)果。再增加處理次數(shù),脫蛋白率增加不明顯且多糖有較大損失。綜合蛋白脫除率和多糖保留率分析,確定木瓜蛋白酶-TCA法聯(lián)用脫蛋白的最優(yōu)工藝為酶用量2%,酶解反應1h,溫度60℃,pH 6,5% TCA處理1次。

圖4 木瓜蛋白酶-TCA法聯(lián)用脫蛋白效果Fig.4 Effect of papain-TCA method on deproteinization

2.6木瓜蛋白酶-Sevag聯(lián)用法脫蛋白結(jié)果

由圖5可知,使用酶法優(yōu)化后,再用Sevag法對蘆薈凝膠多糖脫蛋白,經(jīng)3次處理,蛋白脫除率僅從64.2%上升至78.5%,而多糖保留率則由82.3%下降到68.6%,綜合加權評分1.028,說明蘆薈凝膠多糖經(jīng)酶法處理后,再用Sevag法處理,其蛋白脫除率提高并不明顯,而多糖保留率則降低較多。顯然木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法脫蛋白的效果要優(yōu)于木瓜蛋白酶-Sevag聯(lián)用法,且優(yōu)于各非聯(lián)用法的脫蛋白效果。

圖5 木瓜蛋白酶-Sevag法聯(lián)用脫蛋白效果Fig.5 Effect of papain-Sevag method on deproteinization

3 結(jié)論與討論

本研究考察了TCA法、Sevag法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶-TCA聯(lián)用法和木瓜蛋白酶-Sevag聯(lián)用法脫除庫拉索蘆薈凝膠多糖中蛋白質(zhì)的效果。一般TCA法除蛋白反應較劇烈,易引起多糖降解[13],但本研究結(jié)果表明,木瓜蛋白酶-TCA法聯(lián)用綜合加權評分最高,效果最佳,其蛋白脫除率83.4%,多糖保留率74.9%,優(yōu)于單一脫蛋白的方法。酶法除蛋白溫和高效,有利于多糖活性的保持,聯(lián)合TCA法,能在較少多糖損失的情況下較多的除去蛋白,且避免了Sevag法除蛋白過程中有毒物質(zhì)氯仿的殘留[11]。

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Investigation of deproteinization technology for polysaccharide from gel ofAloevero

HEYi-fei,LIUPing-huai*,HUANGLiang-guo,CHENQiao-ling,SUNYu-wan

(Material and Chemical Engineering College,Hainan University,Haikou 570228,Hainan,China)

To study the deproteinization technology of polysaccharide from gel ofAloevero,the deproteinization rate and the retention rate of polysaccharide were as comprehensive evaluation index,deproteinization effect of five methods including TCA,Sevag,papain,papain-TCA,papain-Sevag on polysaccharide from gel ofAloeverowere compared. Results showed that papain-TCA method was the optimum deproteinization technology and its operation was:the amount of papain 2%,enzymatic time 1h,temperature 60℃,pH 6 and followed by one treatment with 5%TCA. Under this condition,the percentage of deproteinization was 83.4%,and the retention of polysaccharide was 74.9%. Deproteinization effect on polysaccharide from gel ofAloeverohad significant difference by different method,papain-TCA was an effective method for removal of protein from gel polysaccharide ofAloevero.

Aloevero; gel polysaccharide;removal of protein

2013-12-27 *通訊聯(lián)系人

何沂飛(1989-)，男，在讀碩士，主要從事蘆薈產(chǎn)品開發(fā)。

國家科技支撐計劃項目課題(2011BAD14B01)；海南省中藥現(xiàn)代化科技專項(ZY201327)；國家科技型中小企業(yè)技術創(chuàng)新基金(13C26244604892)資助。

TS201.1

B

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001