響應面法優化去皮綠豆多糖提取工藝技術的研究

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(華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640)

響應面法優化去皮綠豆多糖提取工藝技術的研究

余穩穩,吳暉,賴富饒*,閔甜,黃潔明,雷灼貴

(華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640)

以去皮綠豆為主要原料,通過單因素實驗,探討了提取溫度、提取時間、料液比、提取次數等因素對綠豆多糖得率的影響。并且在單因素結果的基礎上,利用響應面分析法優化提取綠豆多糖的最佳工藝條件。實驗結果表明,水提醇沉法提取去皮綠豆多糖的最佳工參數為:提取溫度95.5℃,提取時間3h,料液比為21∶1,提取1次,在此條件下去皮綠豆中可溶性粗多糖的得率可以達到4.32%。經Sevag法脫蛋白后,其中多糖純度為50.35%,蛋白含量為31.26%。

綠豆多糖,熱水浸提,響應面優化法

綠豆又被稱之為文豆、古豆,在我國已有2000年的栽培歷史,產量以及出口量均位居世界首位[1-2]。綠豆是一種高蛋白、低脂肪、高淀粉食物,營養豐富,經濟利用價值高。同時,現代醫學則認為綠豆在抑菌、降脂、抗腫瘤等方面功效頗佳[3]。其原因可能是:綠豆中的某些成分直接具有抑菌作用,其也有可能通過提高人體免疫功能間接發揮殺菌作用；綠豆中所含的植物甾醇與膽固醇很相似,植物甾醇通過與膽固醇競爭酯化酶,從而使其無法酯化進而減少了腸道對于膽固醇的吸收,并可以通過醋精膽固醇異化,或在肝臟阻止膽固醇的生物合成等途徑使生物體內膽固醇含量降低。李一莉[4]等人通過三氯乙酸處理,DEAE柱層析分離等步驟,從綠豆中提取出兩種高活力結晶胰蛋白酶抑制劑A和B,但是含量較低。

賴富饒[5]等學者利用超聲提取法提取綠豆皮水溶性多糖,最終多糖得率為8.54%。同時,其體外抗氧化活性研究結果證明,綠豆皮水溶性多糖的體外抗氧化能力均隨著濃度的增大而加強且粗多糖具有較強的膽酸結合能力；達娃[6]等人利用水提醇沉法提取綠豆粗多糖得率為5.87%,粗多糖中綠豆多糖純度僅僅為38%,但是其并未對提取到的粗綠豆多糖進行進一步的研究。到目前為止,針對去皮綠豆多糖的研究尚未見到報道。

為了研究綠豆中具有生物學活性功能活性的多糖的作用機理,則必須先對其來源予以解釋,因為本研究主要以去皮綠豆為原料,利用熱水浸提法提取其中所含的植物多糖。相比于酶法提取、酸提法[7]、堿提法、超聲提取法等其他提取方法,熱水浸提法具有設備要求低、操作簡單,易于重復的優點。實驗過程中主要研究了提取溫度、提取時間、提取次數以及料液比等因素對最終綠豆多糖得率的影響。在單因素實驗的基礎上,利用響應面分析法優化提取綠豆多糖的最佳工藝條件。提取到的綠豆粗多糖利用Sevag法進行蛋白質的脫除。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

綠豆 廣東省廣州市天河區五山路好當家超市；苯酚,濃硫酸,考馬斯亮藍G250,磷酸,牛血清白蛋白,磷酸氫二鈉,磷酸二氫鈉 均購于廣州卯林儀器有限公司,所用試劑均為分析純。

HH-2數顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵鞏義市予華儀器有限責任公司；5804R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；電熱鼓風干燥箱 上海福瑪實驗設備有限公司；KQ-250DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；箱型馬弗爐 長沙市華光電機廠；FA2204B電子天平 上海精密科學儀器有限公司；JJ200型電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠；RRHP-200型萬能高速粉碎機 歐凱萊芙(香港)竹業公司。

1.2實驗方法

1.2.1 原料的預處理 新買的新鮮綠豆經過夜浸泡之后,剝去皮層于70℃條件下干燥,后經粉碎,過60目篩子,即可得到初始原料粉末[5]。

綠豆→浸泡→去皮→70℃干燥過夜→粉碎→過80目篩→80%乙醇回流3h(脫色并除去可溶性小分子多糖等)→抽濾→濾渣依次用95%乙醇、無水乙醇、丙酮、石油醚清洗→風干→綠豆粉末

1.2.2 綠豆粗多糖的提取 實驗過程中提取綠豆多糖的工藝流程為[8]:綠豆粉末→按一定的料液比加入蒸餾水→在一定溫度下恒溫浸提一定時間→冷卻至室溫→6500 r轉速,20℃條件下離心15min→收集上清液→旋蒸濃縮→用4倍體積乙醇沉淀出多糖(乙醇的最終濃度達到80%)→靜置、過夜→抽濾→用95%乙醇洗滌沉淀并收集沉淀→加水復溶→冷凍干燥→白色、棉絮狀綠豆粗多糖

1.3綠豆多糖的測定方法

本實驗采用苯酚-硫酸法[9-10]分別測定各提取溫度下粗多糖的含量。

(1)

注:M1為綠豆粗多糖的質量；M0為總的樣品質量,A0為綠豆粗多糖中的多糖純度。

1.4蛋白脫除及蛋白含量的測定方法

利用Sevag試劑法除去多糖中的蛋白,該法是脫除蛋白質的經典方法之一,條件溫和,且不會引起多糖結構的變化。其原理是利用有機溶劑使蛋白質發生變性絮凝,對處理液進行靜置、離心分離后,有效脫除蛋白質。本實驗中利用Sevag試劑法進行脫蛋白后,并采用考馬斯亮藍法[11]測定蛋白質的含量。

1.5提取溫度對粗多糖得率的影響

分別稱取5g綠豆粉末,按照1∶15的料液比加入蒸餾水,控制溫度為50、60、70、80、90、95、100℃條件下提取1次,后經離心沉淀冷凍干燥后即得粗綠豆多糖。

1.6料液比對粗多糖得率的影響

分別稱取5g綠豆粉末,按照料液比(M/v)為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的比例加入蒸餾水,95℃條件下提取2.5 h,提取1次,后經離心沉淀后經冷凍干燥得到粗綠豆多糖樣品。

1.7提取次數對粗多糖得率的影響

稱取5g綠豆粉末,在料液比為1∶20、提取溫度為95℃、提取時間為2.5h。后經離心沉淀,上清液按照最終乙醇濃度為80%的條件沉淀粗綠豆多糖,下層沉淀繼續按照之前的實驗條件提取綠豆多糖,重復操作2次,并且記錄每一次的多糖得率。

1.8提取時間對粗多糖得率的影響

取5g已經過預處理的綠豆粉末,按照料液比為1∶20的條件在95℃條件下分別提取1.0、1.5、2.0、2.5、3h。提取液分別經離心、沉淀、冷凍干燥后,測定每個提取時間下的粗綠豆多糖得率。

1.9響應面優化實驗

在單因素實驗結果的基礎上,根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理[12-13],選取影響去皮綠豆中水溶性多糖的主要因素作為響應因素,多糖得率為響應值,進行三因子三水平的響應面分析實驗。實驗因子和水平見表1。

表1 響應面因子及水平表Table 1 The levels of independent variables

1.10數據統計

利用Origin 8.0作圖和Design Expert 7.5進行數據處理。

2 結果與分析

2.1綠豆多糖的單因素結果

2.1.1 溫度對綠豆粗多糖得率的影響 如圖1所示,去皮綠豆中多糖的得率隨著提取溫度的升高而提高。當溫度低于95℃時,隨著溫度的上升,綠豆粗多糖的得率會升高,這可能是由于溫度的升高有利于提高綠豆多糖的溶解度[15]；而當溫度過高時,由于易造成多糖的分解,所以得率反而會下降。因此,在實驗的過程中選擇95℃為最適宜的提取溫度。

2.1.2 料液比對綠豆粗多糖得率的影響 根據圖2可以看出當料液比較低時,提取溶液粘度太高而易發生糊化現象,綠豆樣品粉末難以與水充分混合,造成綠豆樣品粉末吸水不充分浸提不完全,不利于細胞中多糖的溶出,從而使得多糖得率偏低；料液比過高時,多糖得率并未升高反而有所降低,可能是因為多糖是可以與水以任意比互溶的,水量越多時,后續工藝中的提取液的濃縮成本和醇沉中的酒精用量就會增加,提取液中多糖的濃度太低時,相同濃度的酒精就越難以將多糖沉淀出來[16]。在本實驗中,料液比為1∶20時,綠豆多糖的得率最高,故選擇1∶20為最佳料液比。

圖1 提取溫度對去皮綠豆多糖得率的影響Fig.1 The effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide from dehulled mung bean

圖2 料液比對去皮綠豆多糖得率的影響Fig.2 The effect of ratio of water to raw materials on the yield of polysaccharide from dehulled mung bean

2.1.3 提取時間對綠豆粗多糖得率的影響 據圖3可知,提取時間的長短對綠豆樣品中多糖的得率是有一定影響的。提取時間太短,不利于植物細胞的破碎,綠豆樣品中多糖未能充分溶出,從而影響多糖的得率；提取時間太長,可能會使部分多糖在高溫提取過程中被破壞或者降解,降低多糖的得率,并且冷凍干燥后的粗多糖顏色較深,呈淺棕色,影響后期的溶解和吸光度的準確測定,從而影響實際測得的多糖得率。因此,在本實驗中,綜合考慮成本和效率因素后,確定2.5 h為最佳提取時間。

圖3 提取時間對去皮綠豆多糖得率的影響Fig.3 The effect of extraction time on the yield of polysaccharide from dehulled mung bean

2.1.4 提取次數對綠豆粗多糖得率的影響 根據圖4的實驗結果可以看出,從提取第1次到第4次,綠豆多糖的得率從3.29%±0.27%到4.15%±0.19%。根據實驗結果可知,提取1次與提取2次之間,多糖得率上升了26%,而當繼續增加提取次數時,粗多糖得率僅上升非常不明顯。根據圖4結果可知,提取次數對于去皮綠豆粗多糖的得率具有一定影響。經第1次提取之后,第2次只能提取到0.8%左右的綠豆粗多糖。但是由于具有重復操作,乙醇用量較多,實驗過程中以提取1次為基準。

圖4 提取次數對去皮綠豆多糖得率的影響Fig.4 The effect of extraction time on the yield of polysaccharide from dehulled mung bean

2.1.5 響應面法確定去皮綠豆多糖的得率 表2中實驗1～12為析因實驗,13～17為中心實驗。采用Design Expert 7.5對所得的數據進行ANOVA分析,結果見表3[17-19]。二次回歸擬合得到去皮綠豆可溶性多糖的得率回歸方程:

Y=4.03+0.46A+0.045B+0.27C-0.16AB+0.32AC-0.45BC-0.83A2-1.08B2-0.00475C2

表2 Box-Benhnken實驗設計及綠豆多糖的得率Table 2 Response surface Box-Behnken design and results for the extraction yield of polysaccharide

注:a表示平均值±標準偏差,n=3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

注:a 表示顯著水平(p<0.01);b表示顯著水平(p<0.05)。

圖5為根據回歸方程所繪制的響應面分析圖。從響應面的最高點和等值線可以看出,在所選的范圍內有存在著極值,既是響應面的最高點也是橢圓的中心點。根據圖5a可知,A和B的交互作用較強。在編碼只為0以上的B在A很大的范圍內都可以得到較大的反應值,A(溫度)對響應值的影響最大,這與ANOVA的結果相吻合；由圖5b可知,A,C的交互作用不是很大；圖5c表明B,C的交互作用同樣不大,類似于A和C的相同的現象。

圖5 各因素交互作用響應面圖Fig.5 Response surface plots of interaction between each factors

根據Design-Expert軟件,結合二次回歸模型的數學分析結果,可以得到利用水提醇沉法提取去皮綠豆中可溶性多糖的最佳工藝條件為:提取溫度95.5℃,料液比1∶20.7,提取時間為2.875 h。

2.1.6 提取條件優化及驗證 實驗過程中為了驗證該預測的準確性,進行了測試實驗,并對實驗條件進行了優化。當提取溫度為95.5℃,料液比為1∶21,提取時間為3h,提取1次,去皮綠豆多糖的得率可以達到4.32%,與預測的數據相近,如表4所示。

表4 預測性實驗結果Table 4 Predicted and experimental values of polysaccharide at optimum and modified conditions

3 結論

本實驗在單因素的基礎上,確定了提取去皮后綠豆中可溶性多糖的最佳工藝條件,最佳的實驗條件為:溫度95.5℃,料液比1∶21,提取時間3h,提取1次,在此條件下,去皮綠豆中多糖的得率可以達到4.32%,經Sevag法脫蛋白后,多糖純度可以達到50.35%,其中蛋白質含量為31.26%。

通過響應面分析法可以確定各因素及其交互作用在工藝過程中對響應值的影響,精確表達因素和響應值之間的關系,并為尋求最優實驗條件并降低開發的時間和成本。利用響應面分析法優化從去皮綠豆中提取可溶性綠豆多糖的工藝條件,可以有效地降低工藝條件組合的繁雜性,為綠豆的綜合利用提供一些理論指導。

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Study of extracting water-soluble polysaccharide from dehulled mung bean by response surface methodology

YUWen-wen,WUHui,LAIFu-rao*,MINTian,HUANGJie-ming,LEIZhuo-gui

(School of Light Industry and Food Sciences of South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

Experiments concerning extracting polysaccharide from dehulled mung bean have been conducted. Particularly,the effects of factors(extraction time,the ration of raw materials to water,extraction times and extraction temperature)on the yield of polysaccharide have been studied as well. Based on the single-factor experiments,response surface methodology had been employed to optimize extraction conditions. Results indicated that the optimum conditions for polysaccharide from dehulled mung bean extraction were:water temperature of 95.5℃,a ratio of water to raw materials of 21∶1(V/m)and an extraction time of 3h. Under this conditions,the yield of polysaccharide reached 4.32%. Following this,Sevag methodology has been used to remove the protein contained in polysaccharide as well. After deproteination,the content of polsaccharide reached 50.35% while there is still approximately 31.26% of protein.

mung bean polysaccharide;hot-water extraction;response surface methodology

2014-02-10 *通訊聯系人

余穩穩(1989-)，男，碩士，研究方向：食品安全與天然產物化學。

TS219

B

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001