丙酮-磷酸氫二鉀雙水相體系提純黃褐毛忍冬中的綠原酸

,, ,, ,齊勝,,2,*

(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550001；2.貴州師范大學(xué) 貴州省植物生理與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng) 550001)

丙酮-磷酸氫二鉀雙水相體系提純黃褐毛忍冬中的綠原酸

何磊磊1,玉秋萍1,張妮1,王家勝1,孔琪1,張齊勝1,余正文1,2,*

(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550001；2.貴州師范大學(xué) 貴州省植物生理與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng) 550001)

本研究采用丙酮-磷酸氫二鉀雙水相體系法提純黃褐毛忍冬中的綠原酸,通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)測(cè)定了酮水比、鹽液比和料液比對(duì)綠原酸萃取率及提取物純度的影響。結(jié)果表明:按酮水比8.5∶1.5(V/V),鹽液比為100∶1(mg/mL)配制雙水相,料液比25∶1(mg/mL),綠原酸的萃取率為91.10%,純度從原料中的20.16%提高到42.13%。該工藝溶劑易回收、易處理、操作簡(jiǎn)便,適于黃褐毛忍冬中綠原酸的提純。

丙酮-磷酸氫二鉀,雙水相體系,黃褐毛忍冬,綠原酸

忍冬科植物黃褐毛忍冬(Lonicerafulvotomentosa)首載于《植物分類學(xué)報(bào)》1979年17卷,2010年版《中國(guó)藥典》將其定為山銀花藥材基源植物之一。黃褐毛忍冬富含揮發(fā)油、有機(jī)酸、黃酮及皂苷類化合物[1],其中綠原酸是其主要活性成分,具有利膽、抗菌、抗病毒、止血、增加白血球、縮短血凝和出血時(shí)間以及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等藥理活性[2]；臨床上用于治療急性咽喉炎癥和化膿性皮膚疾病。目前黃褐毛忍冬中綠原酸的分離純化方法主要有改良醋酸乙酯法、正丁醇分離法、異戊醇法、水提醇沉法、石灰-硫酸法、水提石灰乳沉淀法、β-環(huán)糊精(β-CD)包埋法、柱層析法、大孔樹(shù)脂吸附法和超濾法等[3]。這些方法存在提取物中綠原酸的純度較低或分離成本高等缺點(diǎn),大多局限于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備。因此,有必要探求一種適合工業(yè)化生產(chǎn)的提取工藝。

雙水相萃取分離技術(shù)是一種新型的分離技術(shù),因具有分離效果好,不影響提取物質(zhì)的活性等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物分離、生物活性物質(zhì)提取、制藥、食品添加劑、日用化工等領(lǐng)域[4-7]。霍清等[8]研究了綠原酸純品在丙酮-磷酸氫二鉀雙水相體系中的分配行為；陶湘輝[9]還采用大孔樹(shù)脂純化灰氈毛忍冬中綠原酸。本文通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化丙酮-磷酸氫二鉀雙水相體系提取黃褐毛忍冬中綠原酸的提取工藝條件,研究結(jié)果為高純度綠原酸的分離奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

黃褐毛忍冬材料于2011年7月采于安龍縣德臥鎮(zhèn)大水井村,由貴州師范大學(xué)方小平教授鑒定為忍冬科植物黃褐毛忍冬(Lonicerafulvotomentosa)的干燥花蕾,樣品存放于貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院天然產(chǎn)物研究室。綠原酸純品(含量>98%,長(zhǎng)沙上禾生物科技有限公司)；丙酮(重慶江川化工有限公司)、磷酸氫二鉀(上海廣諾化學(xué)科技有限公司)；實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純。

UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；KQ-500DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制:精密稱取純度為98%的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5mg,用50%甲醇溶液溶解在100mL棕色容量瓶中,超聲波10min。用50%甲醇定容,制成0.2mg/mL的溶液作為母液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:準(zhǔn)確分別吸取上述母液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于6個(gè)10mL的容量瓶中并標(biāo)好記號(hào),再用50%甲醇溶液定容,分別配制成0、2、4、6、8、10μg/mL的溶液。將這些配好的溶液置于UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中,測(cè)定吸光度值。

1.2.2 黃褐毛忍冬中綠原酸的提取 準(zhǔn)確稱取黃褐毛忍冬花蕾100g置于燒杯中,向燒杯中加入8倍的70%的乙醇,在超聲清洗器中超聲提取20min,超聲功率為180W[10]；提取后過(guò)濾并收集濾液,在濾渣中加入溶劑(70%乙醇)繼續(xù)超聲提取2次,超聲時(shí)間20min,超聲功率180W,將3次所得濾液收集濃縮揮發(fā)去乙醇,得到黃褐毛忍冬中綠原酸的初提物。

1.2.3 初提物中綠原酸含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取上述初提物127mg于10mL試管中加入10mL的50%甲醇溶液,超聲20min,超聲功率為180W,充分溶解,靜置過(guò)夜。取萃取液過(guò)濾,將得到的濾液用50%甲醇稀釋400倍,以50%甲醇溶液作對(duì)照,測(cè)定其吸光值。

1.2.4 雙水相的配制及綠原酸的提取 分別準(zhǔn)確稱取一定量黃褐毛忍冬初提物,分別置于100mL的三角瓶中,加入蒸餾水超聲輔助提取15min,使樣品充分溶解,再加入相應(yīng)量的丙酮,超聲5min。最后再加入相應(yīng)的鹽,超聲提取10min,讓鹽充分溶解,然后把整個(gè)體系轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,靜置過(guò)夜,讓體系充分分相。待體系在分液漏斗中充分分相后,將下相放掉,用移液槍把萃取液全部吸至50mL的容量瓶中,然后再用丙酮定容至50mL。

將上述定容好的萃取液溶液用0.22μm有機(jī)過(guò)濾膜過(guò)濾,然后稀釋至400倍。將稀釋好的上清液用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)λ=323nm下測(cè)定其吸光值,將吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0713x+0.0097得各試管的綠原酸濃度,并計(jì)算萃取率,萃取率(%)=綠原酸提取的質(zhì)量/綠原酸總量×100；同時(shí)取上述濾液10mL,烘干、稱重,計(jì)算提取物純度,純度(%)=綠原酸提取的質(zhì)量/萃取物質(zhì)量×100。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 料液比的影響 固定丙酮∶水=8∶2(40mL∶10mL),磷酸氫二鉀和丙酮水溶液比80∶1(4000mg∶50mL),按照料液比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1分別稱取黃褐毛忍冬提取物250、500、750、1000、1250mg,按1.2.3法處理并計(jì)算綠原酸的萃取率及純度,結(jié)果見(jiàn)圖1。

1.2.5.2 酮水比的影響 固定鹽液比80∶1(4000mg∶50mL),初提物和丙酮水溶液比15∶1(750mg∶50mL)、分別以丙酮∶水=7∶3(35∶15)、7.5∶2.5(37.5∶12.5)、8∶2(40∶10)、8.5∶1.5(42.5∶7.5)、9∶1(45mL∶5mL)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),按1.2.3法處理并計(jì)算綠原酸的萃取率及純度,結(jié)果見(jiàn)圖2。

1.2.5.3 鹽液比的影響 固定料液比15∶1(750mg),丙酮∶水=8∶2(40∶10),以磷酸氫二鉀和丙酮水溶液比40∶1(2000∶50)、60∶1(3000∶50)、80∶1(4000∶50)、100∶1(5000∶50)、120∶1(6000mg∶50mL)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),按1.2.3法處理并計(jì)算綠原酸的萃取率及純度,結(jié)果見(jiàn)圖3。

1.2.6 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),選用料液比、酮水比和鹽液比三個(gè)實(shí)驗(yàn)因素為自變量,以綠原酸的萃取率和純度為考察指標(biāo),設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn),確定最佳提取條件。因素與水平見(jiàn)表1,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與討論

2.1綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

將1.2.1中配好的溶液置于UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中,在200～400nm之間進(jìn)行紫外檢測(cè),綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液在323nm處有最大吸光度[11]。以溶液濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理,繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0713x+0.0097,R2=0.9994；曲線在0～1之間線性關(guān)系良好。

2.2初提物中綠原酸含量

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算初提物中綠原酸純度,結(jié)果為20.16%。

2.3單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.3.1 料液比對(duì)萃取率及純度的影響 料液比對(duì)萃取率和純度的影響見(jiàn)圖1。固定酮水比和鹽液比兩因素不變,料液比增大時(shí),平均萃取率和平均萃取物純度都增大,萃取率和純度隨初提物的加入呈上升趨勢(shì),但初提物溶解也越困難。經(jīng)驗(yàn)證料液比為30∶1時(shí)初提物不能完全溶解,選取25∶1較為合適。

圖1 料液比對(duì)萃取率和純度的影響Fig.1 Effect of material/liquid ratio on extraction rate and purity

2.3.2 酮水比對(duì)萃取率及純度的影響 酮水比對(duì)萃取率和純度的影響見(jiàn)圖2。固定料液比和鹽液比兩因素不變,萃取率隨酮水比的增加呈下降趨勢(shì),萃取物純度呈上升趨勢(shì)。酮水比低時(shí),萃取率較高但萃取物純度較低；酮水比高時(shí),萃取率較低但萃取物純度較高。當(dāng)酮水比為9∶1時(shí),萃取率急劇下降,同時(shí)純度提高較多。隨酮水比增大,萃取率降低導(dǎo)致原料損失,綜合考慮,選取8.5∶1.5較為合適。

圖2 酮水比對(duì)萃取率和純度的影響Fig.2 Effect of acetone/water ratio on extraction rate and purity

2.3.3 鹽液比對(duì)萃取率及純度的影響 鹽液比對(duì)萃取率和純度的影響如圖3。固定料液比和酮水比兩因素不變,只改變鹽液比。萃取率隨鹽液比增大而減小,而純度隨鹽液比增大而增大。鹽用量低時(shí),萃取率較高但萃取物純度較低；鹽用量高時(shí),萃取率降低不明顯但萃取物純度顯著較高。同時(shí),加入的鹽含量較多時(shí),下相較粘稠,且鹽很難溶解完全,這樣不僅會(huì)造成鹽的浪費(fèi),而且也不利于物質(zhì)在相間的擴(kuò)散。雖然鹽液比對(duì)綠原酸的萃取率和萃取物純度影響相差不大,但從分相難易和經(jīng)濟(jì)角度來(lái)考慮,選擇100∶1比較合適。

2.4正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

根據(jù)2.3.1、2.3.2、2.3.3單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,利用正交設(shè)計(jì)助手軟件,選取料液比、酮水比、鹽液比為實(shí)驗(yàn)因素,并設(shè)置誤差空列項(xiàng),采用3因素3水平L9(34)進(jìn)行正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),以萃取物純度為主要因素考慮。

從表2中可以得出各因素對(duì)提取結(jié)果的影響,極差R反映各因素作用的大小,極差越大的因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)所造成的影響也越大,其中酮水比是影響提取物中綠原酸萃取率和純度的主要因素。由表2的極差分析,從萃取率角度考慮,最佳組合是A3B1C1,即料液比25∶1(mg/mL)、酮水比8∶2(v/v)、鹽液比80∶1(mg/mL)；而從萃取物純度角度上考慮,最佳組合是A3B3C2,即料液比25∶1(mg/mL)、酮水比9∶1(v/v)、鹽液比100∶1(mg/mL)。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance for the orthogonal array design

注:*表示在p<0.05水平上顯著。

由表3的方差分析可知,A、B兩個(gè)因素均顯著,且A3B1C1、A3B3C2組合中的A因素均是A3水平,故A因素確定為A3；B因素也是顯著因素,但在料液比25∶1(mg/mL)時(shí)原料不能完全溶解,損失較多,故選擇酮水比B2；C因素不顯著,C1、C2的選擇不重要,但鹽液比為C2易于分相,故選作C2。即A3B2C2組合,為料液比25∶1(mg/mL)、酮水比8.5∶1.5(v/v)、鹽液比100∶1(mg/mL)。三組實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證結(jié)果如表4,A3B2C2條件下的萃取率為91.10%±0.23%,純度為42.13%±0.31%,易于操作,適于綠原酸的提純。

表4 組合結(jié)果Table 4 Results of combination

3 結(jié)論

用70%乙醇從黃褐毛忍冬花蕾中提取綠原酸,再用丙酮/磷酸氫二鉀配成的雙水相萃取純化初提物。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)考察了料液比、酮水比和鹽液比對(duì)綠原酸萃取率及提取物純度的影響；考慮分相難易和原料損失情況,最后確定最佳提取工藝為料液比25∶1(mg/mL)、酮水比8.5∶1.5(V/V)、鹽液比100∶1(mg/mL)。在該工藝條件下綠原酸的萃取率為91.10%,提取物純度從20.16%提高到42.13%。

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Separation and purification of chlorogenie acid fromLonicerafulvotomentosawith aqueous two-phase systems containing acetone and Dipotassium Hydrogen Phsophate

HELei-lei1,YUQiu-ping1,ZHANGNi1,WANGJia-sheng1,KONGQi1,ZHANGQi-sheng1,YUZheng-wen1,2,*

(1.School of Life Sciences,Guizhou Normal University,Guiyang 550001,China,2. Key Laboratory of Plant Physiology and Development Regulation of Guizhou Province,Guizhou Normal University,Guiyang 550001,China)

Chlorogenie acid was separated and purified fromLonicerafulvotomentosacrude extract by acetone-K2HPO4two-phase aqueous system. Influence of material/liquid ratio,acetone/water ratio and salt/liquid ratio on extraction rate and purity of chlorogenie acid was investigated by orthogonal test. The results showed that extraction yield of chlorogenie acid was 91.10%under acetone-water ratio for 8.5∶1.5(V/V),salt-solvent ratio for 100∶1(mg/ml)and material-solvent ratio for 25∶1(mg/mL),the purity of chlorogenie acid increases from 20.16% with crude extract 42.13%. This method was easy to recovered solvent,dispose and operate,which fit for purification of chlorogenie acid fromLonicerafulvotomentosa.

acetone-K2HPO4;aqueous two-phase system;Lonicerafulvotomentosa;chlorogenie acid

2014-01-13 *通訊聯(lián)系人

何磊磊(1984-)，男，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31060056)；貴州師范大學(xué)博士科研項(xiàng)目；貴州省中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)(黔科合中藥字[2011]5046號(hào))；貴州省科技基金項(xiàng)目(黔科合J字[2011]2368號(hào))；貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(黔科合人才團(tuán)隊(duì)[2009]4007號(hào))。

TS201.1

B

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001