響應面法優化魯氏接合酵母產MAP酶條件

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(湖南農業大學食品科技學院,湖南長沙 410128)

響應面法優化魯氏接合酵母產MAP酶條件

謝夢琴,王遠亮*

(湖南農業大學食品科技學院,湖南長沙 410128)

為研究產MAP酶的最佳培養條件,以魯氏接合酵母為原料,MAP酶為響應值,在單因素實驗的基礎上根據Box-behnken實驗設計原理,采用三因素三水平的響應面分析法對MAP酶培養條件進行優化,通過響應面實驗,建立了MAP酶含量與三個因素變化的二次回歸方程。同時根據回歸模型進行了計算機模擬實驗并繪制了曲面圖,探索MAP酶隨主要因素水平的變化規律與優化點。結果表明,魯氏接合酵母產MAP酶最佳培養條件為:溫度27℃、鹽濃度9.28%、培養時間80.4h,此培養條件下MAP酶濃度3.189ng/mL。

MAP酶,魯氏接合酵母,響應面分析

促有絲分裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAP酶)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,存在于酵母和哺乳動物細胞中[1]。MAPK鏈是由MAPKKK、MAPKK和MAPK三類蛋白激酶組成,是酵母菌和動物體內一種重要的信號傳遞途徑[2-3]。生物在受到諸如機械壓力、創傷、鹽害(滲透壓改變)、極端溫度等不同的創傷時,均能誘導和激活MAPK鏈,將不同的細胞膜感受器與細胞應答聯系起來,響應各種生物以及非生物脅迫[4]。在現代醬油的釀造很多都是采用高鹽稀態的發酵方法,在高鹽的環境下,大多微生物都死亡,而耐鹽魯氏接合酵母在醬油后酵過程中產生醇和酯類等與醬油風味及其相關的物質,對醬油獨特風味的形成有十分重要的貢獻[5-7]。優化魯式接合酵母產MAP酶條件,對魯式氏接合酵母應對這種高鹽環境很有理論意義。

響應面分析法(response surface methodology)系采用多元二次回歸方法作為函數估計的工具,包括實驗設計、建立模型、分析模型合理性和尋求最優解等眾多實驗與統計技術[8]。響應面分析法可以減少實驗次數、優化實驗條件、提高生產效率、解決生產實際問題。該法在生物培養方面已有廣泛應用,韓學易[9]等利用響應面法優化巨大芽孢桿菌產纖維素酶發酵條件后,纖維素酶活力為2.152U/mL,提高了50%。張大皓[10]等利用響應面優化脂肪酶發酵條件,酶活比之前提高了43%。因此,本實驗采用單因素實驗和Design-Expert軟件中的Box-Benhnken設計法、響應面分析方法對魯氏接合酵母產MAP酶條件優化,為魯氏接合酵母更好適應醬油后期發酵提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

魯氏接合酵母 湖南農業大學食品科技學院微生物實驗室提供；葡萄糖 北京鼎國有限公司；氯化鈉 北京鼎國有限公司；MAP2 ELISA試劑盒 購自SIGMA公司；蝸牛酶 北京鼎國有限公司；PDA培養基:馬鈴薯汁200g、葡萄糖20g、水1000mL；不同NaCl濃度PDA培養基:分別取2、4、6、8、10、12gNaCl到50mL容量瓶中,用PDA培養基定容至50mL,配制成鹽濃度分別為4%、8%、12%、16%、20%、24%的PDA培養基,備用。

SKY-2102C搖床培養箱 國力天(深圳)科技有限公司；TGL-20M冷凍離心機 長沙英泰儀器有限公司；U410-86-80℃冰箱 New Brunswick Scientific Coopration；HH-8數顯恒溫水浴鍋 上海浦東物理光學儀器廠；WellWash4 MK2洗板機 賽默飛世爾科技(中國)有限公司；MB100-2A恒溫振蕩器 賽默飛世爾科技(中國)有限公司；3001酶標儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 培養方法 魯氏結合酵母在PDA斜面培養基上30℃培養24～36h,用無菌的生理鹽水將其制備成濃度為1×107CFU/mL的菌懸液。100mL三角瓶中裝入PDA培養基20mL,按3%接種量接入魯氏接合酵母菌懸液,轉速120r/min,28℃搖床培養48h。

1.2.2 魯氏結合酵母蛋白的提取 取10mL菌懸液,離心,收集菌體,加入2mL 100mg/L濃度的蝸牛酶將菌沉淀懸起后常溫下孵育20min,-80℃冰箱放置10min后,迅速移至37℃水浴箱10min,反復5次左右,離心收集上清液。

1.2.3 MAP酶測定方法 分別在酶標板上設置微管相關蛋白標準品孔12個,每兩個孔為一個編號,樣品孔1個、空白孔1個,分別在不同編號的標準品孔中分別加入0.6、0.4、0.2、0.1、0.05ng/mL的微管相關蛋白標準品、樣品孔中加入樣品稀釋液40μL和待測樣品10μL,空白孔加入50μL樣品稀釋液,37℃溫育30min后,用洗滌液清洗5次,拍干,再往酶標板孔中加入酶標試劑50μL(空白孔除外),37℃溫育30min后,洗滌,加入50μL顯色劑A和顯色劑B,混勻,37℃避光顯色15min后,加入終止液50μL,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值),繪制標準曲線并算出各樣品濃度。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 溫度對MAP酶含量的影響 取PDA培養基5份,在0.3%的接種量,自然pH,鹽濃度為8%,轉速為120r/min的條件下培養,培養的溫度分別為20、24、28、32、36℃,培養3d,用MAP酶聯免疫方法測其濃度。

1.2.4.2 時間對MAP酶含量的影響 取PDA培養基5份,在0.3%的接種量,自然pH,鹽濃度為8%,溫度28℃、轉速為120r/min的條件下培養,培養時間分別為2、3、4、5、6d,用MAP酶聯免疫方法測其濃度。

1.2.4.3 鹽濃度對MAP酶含量的影響 取PDA培養基5份,在0.3%的接種量,自然pH,轉速為120r/min的條件下培養,培養的鹽濃度分別為0、4%、8%、12%、16%,20%、24%,培養3d,用MAP酶聯免疫方法測其濃度。

1.2.5 響應面優化實驗設計 采用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-behnken(BBD)中心組合實驗設計原理設計響應面實驗。根據單因素影響實驗結果,選取培養時間、溫度及鹽濃度3個因素作為實驗因素,以MAP酶含量作為響應值,采用三因素三水平的響應面分析方法設計實驗,實驗因素及水平見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of the response surface method

2 結果與分析

2.1 MAP酶標準曲線

以MAP酶濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,其線性回歸方程為:y=5.4928x-0.2422,R2=0.9959。說明曲線可信度較高,可以應用。

圖1 MAP酶標準曲線Fig.1 Calibration curve of MAPase

2.2單因素實驗結果

2.2.1 培養溫度對MAP酶濃度的影響 從圖2可以看出,培養溫度對MAP酶濃度影響較大,當溫度為20～28℃時,隨溫度增加MAP酶濃度明顯增加,在28℃時達到最高,溫度28～36℃時MAP酶濃度明顯下降。原因是高溫影響了魯氏接合酵母的生長,影響了MAP酶的產生,因此選擇溫度28℃為宜。

圖2 溫度對MAP酶濃度的影響Fig.2 Effect of temperature on MAPase concentration

2.2.2 培養時間對MAP酶濃度的影響 從圖3可以看出,培養時間對MAP酶濃度影響顯著。在8%鹽濃度條件下,培養前期的1～3d內,MAP酶濃度隨培養時間的延長而逐漸上升；但隨著時間的進一步延長,MAP酶在發酵液中的濃度有所下降。因為此時魯氏接合酵母已經進入生長周期的穩定期,MAP的產量主要受酵母菌活菌影響,故選擇培養時間3d為宜。

圖3 培養時間對MAP酶濃度的影響Fig.3 Effect of time on MAPase concentration

2.2.3 鹽濃度對MAP酶濃度的影響 由圖4可知,鹽濃度對MAP酶濃度影響十分明顯。料液比在0%～8%之間時,MAP酶濃度隨鹽度的增加而上升,在這樣的鹽濃度內,可能是由于鹽脅迫激活了MAP酶鏈,產生MAP酶響應這種高鹽脅迫,從而產生大量的MAP酶。而隨著鹽濃度進一步增加,MAP酶含量明顯下降,是因為此時鹽的濃度已經影響了魯氏接合酵母菌的生長,因此選擇鹽濃度為8%。

圖4 鹽濃度對MAP酶濃度的影響Fig.4 Effect of salt on MAPase concentration

2.3響應面優化實驗結果與分析

2.3.1 回歸模型的建立及其分析 利用Design-Expert7.1.6統計軟件對表2數據進行多項式回歸分析,建立魯氏接合酵母產MAP酶的最適培養條件的回歸模型,得到MAP酶活對編碼自變量A、B及C的二次多項回歸方程。

通過多元回歸擬合分析得到以MAP酶濃度為目標函數與各因變量溫度,時間,鹽濃度的二次回歸方程模型:

MAP酶濃度=3.11+0.073A+0.19B+0.19C-0.39AB-0.34AC-0.29BC-0.34A2-0.27B2-0.28 C2

對該模型進行方差分析及模型系數進行顯著性檢驗,結果見表3。p<0.05表示該項指標顯著,由表3可知,回歸模型極其顯著(p<0.0001),說明建立的模型有意義；失擬項p=0.0503>0.05,無顯著性差異,說明模型擬合度良好,可用此模型和方程來分析和預測。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of the response surface method

由表4可知,Y的變異系數CV表示實驗的精確度,CV值越高,實驗的可靠性越低,本實驗中CV=1.96,較低,說明實驗操作可信。

表3 響應面方差分析結果Table 3 Result of response surface quadratic model

注:**,p<0.01,差異極顯著。

表4 模型的可信度分析Table 4 Analysis for determination of model

2.3.2 響應曲面分析與優化 響應面圖是利用軟件根據回歸方程繪制的,是響應值在各實驗因素交互作用下得到的結果構成的一個三維空間曲面,可以預測和檢驗變量的響應值以及確定變量的相互關系。分析當溫度、時間和鹽濃度其中有1個因素固定時,另外2個因素及其交互作用對MAP酶濃度的影響。根據回歸方程做出模型的響應曲面見圖5～圖7。

圖5 培養溫度與時間對MAP酶濃度影響的曲面圖Fig.5 The response surface polt for the effects of the temperature and time on MAPase concentration

圖6 鹽濃度與溫度對MAP酶濃度影響的曲面圖Fig.6 The response surface polt for the effects of the salt and temperature on MAPase concentration

圖7 鹽濃度與時間對MAP酶濃度影響的曲面圖Fig.7 The response surface polt for the effects of the salt and time on MAPase concentration

響應面圖形是響應值對各實驗因子X1,X2,X3所構成的三維空間的曲面圖,從響應面分析圖上可形象地看出最佳參數及各參數之間的相互作用。響應面圖有頂峰,證實影響因素的最佳值落在實驗設計的取值范圍內。由響應面圖可以看出,在鹽濃度一定時,隨著時間與溫度增加,魯氏接合酵母中MAP酶濃度先增加后減小；在時間一定時,隨著鹽濃度與溫度增加,魯氏接合酵母中MAP酶濃度先增加后減小；在溫度一定時,隨著鹽濃度與時間的增加,魯氏接合酵母中MAP酶先增加后減小。利用Design-Expert7.1.6進行優化處理得到魯氏接合酵母產MAP酶最優的培養條件為:溫度27℃、鹽濃度9.28%,培養時間80.4h,此條件下魯氏結合酵母產MAP酶濃度為3.166ng/mL。

2.3.3 驗證實驗 根據單因素實驗與響應面實驗得到的結果,得到魯氏接合酵母產MAP酶的最優培養條件為溫度27℃、鹽濃度9.28%、培養時間80.4h,做5組驗證實驗,得其MAP酶濃度為3.189±0.177ng/mL,預測值與實驗值之間具有良好的擬合性,表明模型有效、可靠。

3 結論

本研究是在單因素實驗結果基礎上,利用響應面法優化魯氏接合酵母產MAP酶條件,通過對實驗結果進行方差分析可知,本實驗中對MAP酶濃度的影響程度大小依次為鹽濃度>時間>溫度。研究結果表明魯氏接合酵母產MAP酶最佳培養條件為溫度27℃、鹽濃度9.2%,培養時間80h,此培養條件下魯氏接合酵母MAP酶的濃度為3.189ng/mL。

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Optimization of MAPASE producing fromZygosaccharomycesrouxiiby response surface method

XIEMeng-qin,WANGYuan-liang*

(College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

Using MAPase concentration as the response value,Zygosaccharomycesrouxiias the raw material to study the optimal MAPK conditions. Based on the result of single-factor test,response surface methodology with 3 factors and 3 levels was adopted according to box-behnken experiment design principle. Two regression equations for the influence relationship of MAPase concentration and three varietals factors were established. On the basis of regression models,the results with surface were simulated to give optimized result and trends of the main factors on the educing sugar concentration. The optimal MAPK conditions were as follows:the temperature was 27℃,salt Concentration 9.28%,time 80.4 hours. Under this condition the MAPase concentration was 3.189ng/mL.

MAPase;Zygosaccharomycesrouxii; response surface method

2014-03-05 *通訊聯系人

謝夢琴(1989-)，女，碩士，研究方向：食品生物技術。

國家自然基金項目(31000809)。

TS264.2

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001