響應(yīng)面法優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶水解棉籽蛋白工藝

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(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730030)

響應(yīng)面法優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶水解棉籽蛋白工藝

高丹丹,祁高展*,郭鵬輝

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730030)

采用風(fēng)味蛋白酶對(duì)棉籽蛋白進(jìn)行水解,研究酶與底物濃度比(E/S)、時(shí)間、pH和溫度變化對(duì)酶解過程的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)分析基礎(chǔ)上,以水解度(DH)為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用Box-Benhnken響應(yīng)面分析法,設(shè)計(jì)了三因素三水平的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化棉籽蛋白質(zhì)的水解條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)E/S為6000U/g,最優(yōu)水解條件為:溫度50℃、水解pH為7.45、水解時(shí)間4.14h,在此水解條件下,水解度可達(dá)到59.01%±0.81%。

酶解,棉籽蛋白,響應(yīng)面,風(fēng)味蛋白酶

全球每年棉籽產(chǎn)量約4200～4500萬噸,棉籽蛋白占全部食用蛋白的6%。棉籽蛋白質(zhì)氨基酸組成齊全,比例合理,營養(yǎng)價(jià)值接近豆類蛋白質(zhì),沒有大豆蛋白的腥味,不含脹氣因子,是一種十分重要的植物蛋白質(zhì)資源[1]。中國是一個(gè)產(chǎn)棉大國,棉籽產(chǎn)量居世界第一,約占世界總產(chǎn)量的六分之一。但在我國,由于棉仁中棉酚的存在,使得棉籽脫脂餅粕僅少量用于飼料,多數(shù)當(dāng)作肥料肥田。這在目前人類食用蛋白日益缺乏的情況下是一種資源浪費(fèi)。

隨著棉籽脫酚技術(shù)的發(fā)展,現(xiàn)在市場(chǎng)上食用級(jí)棉籽蛋白的棉酚含量在0.02%以下,很多國家已經(jīng)開始利用棉籽蛋白生產(chǎn)食品和食品添加劑。自1990年有學(xué)者對(duì)棉籽蛋白的營養(yǎng)特性和加工特性進(jìn)行了研究,也有學(xué)者用蛋白酶對(duì)棉籽蛋白進(jìn)行水解,觀測(cè)其水解后功能特性的變化。2008年,于繼兵等[2]以棉籽蛋白為底物,采用木瓜蛋白酶進(jìn)行水解,發(fā)現(xiàn)水解物具有抗氧化能力。2009年,劉軍[3]采用酶法水解棉籽蛋白,發(fā)現(xiàn)其水解物具有的抗氧化活性和ACE抑制活性。他們的研究雖然發(fā)現(xiàn)棉籽蛋白水解物具有生物活性,但都沒有分離出具體的活性肽。2010年,我們從棉籽蛋白水解物中分離出一條高活性ACE 抑制肽,其氨基酸序列為FPAIGMK[4-6]。2011年,常通[7]采用枯草芽孢桿菌(NCT314)發(fā)酵棉籽蛋白,從發(fā)酵液中分離出一條氨基酸序列為LPGVY的棉籽ACE抑制多肽,這些研究為棉籽蛋白的開發(fā)利用提供了良好的平臺(tái)和方向。

酶解能夠使原來蛋白質(zhì)的功能特性發(fā)生很大變化,這些特性的改變很大程度上取決于水解度的大小。嚴(yán)格控制水解度,選擇在合適的時(shí)機(jī)中止酶解反應(yīng),才能獲得具有不同分子量大小、不同溶解性的功能特的產(chǎn)品,同時(shí)又可以避免肽鏈的過度失控水解形成苦味物質(zhì)[8]。所以,在水解過程中,水解度的檢測(cè)及控制具有十分重要的意義,應(yīng)當(dāng)予以足夠的重視。本研究立足國內(nèi)外對(duì)植物蛋白研究的熱點(diǎn),用風(fēng)味蛋白酶對(duì)棉籽蛋白進(jìn)行水解,并利用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解棉籽蛋白的水解條件進(jìn)行優(yōu)化,為棉籽蛋白的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

脫酚棉籽分離蛋白(總蛋白質(zhì)含量84.0%,水分含量為7.4%) 自制；風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme 1000L,活力為30000U/mL) 丹麥諾維信酶制劑公司；TCA、茚三酮、正丁醇、氫氧化鈉、鹽酸等 分析純?cè)噭?/p>

3K18型Sigma高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；PB-10型精密pH計(jì) Sartorius公司；GL-3250B控溫磁力攪拌器 江蘇其林貝爾儀器制造有限公司；MP-500B電子天平 上海天平總廠；Labconco Freezoneil臺(tái)式凍干系統(tǒng) 上海比朗儀器有限公司；HH-SH-4型電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學(xué)儀器廠；6010型紫外分光光度計(jì) 惠普有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 棉籽蛋白酶解液制備 配制5%的棉籽蛋白質(zhì)溶液,調(diào)節(jié)至一定的pH,然后按一定比例加入酶,在一定溫度下進(jìn)行水解,95℃水浴滅酶15min,加入一定量的10%的TCA,10000r/min離心15min,沉降酶蛋白和未水解的棉籽蛋白質(zhì),上清液保存在-20℃待分析用。

1.2.2 蛋白水解液水解度測(cè)定 水解度的測(cè)定方法采用茚三酮比色法[9]。

水解度(DH)的計(jì)算公式:

DH(%)=[(Ah-A0)/(A1-A0)]×100

式中:Ah為不同時(shí)間酶解液中的總游離氨基數(shù),mmol；A1為原料蛋白強(qiáng)酸水解后的總游離氨基數(shù),mmol；A0為原料蛋白中固有的游離氨基數(shù),mmol。

1.2.3 風(fēng)味蛋白酶水解棉籽蛋白單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以棉籽蛋白DH(水解度)為評(píng)定指標(biāo),在酶與底物濃度比(E/S)為6000 U/g、溫度為40℃、pH為7.0的條件下,研究不同酶解時(shí)間(1、2、3、4、5、6和7h)對(duì)水解效果的影響；在設(shè)定酶與底物濃度比(E/S)為6000 U/g、溫度為40℃、水解時(shí)間為4h,研究pH(分別為6、6.5、7.0、7.5、8.0)對(duì)水解效果的影響；在酶與底物濃度比(E/S)為6000U/g、水解時(shí)間為4h、pH為7.0的條件下,研究不同溫度(分別為20、30、40、50、60℃)對(duì)水解效果的影響；在溫度為40℃、pH7.5、酶解時(shí)間為4h的條件下,研究E/S(分別為2000、4000、6000、8000和10000U/g)對(duì)水解效果的影響,確定各因素的最佳水平。

1.2.4 風(fēng)味蛋白酶水解棉籽蛋白響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)在單因素分析基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,以水解度(DH)為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)三因素(溫度、pH和時(shí)間)三水平實(shí)驗(yàn),因素水平見表1。處理數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert 8.0完成。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design and variables levels for Box-Behnken

2 結(jié)果與分析

2.1風(fēng)味蛋白酶水解棉籽蛋白單因素實(shí)驗(yàn)分析

2.1.1 水解時(shí)間對(duì)酶解過程的影響 水解時(shí)間影響水解度的曲線如圖1所示,隨著時(shí)間的延長,水解度逐漸升高。但當(dāng)水解時(shí)間達(dá)到4h后,水解曲線上升趨于平緩。可能有以下幾點(diǎn)原因,隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行:底物濃度減小,反應(yīng)位點(diǎn)逐漸被酶分子飽和；產(chǎn)物濃度增加,其競爭性抑制變強(qiáng)；中間復(fù)合物[ES]在經(jīng)歷了初始階段的積累后達(dá)到穩(wěn)態(tài),趨于恒定[10]。從節(jié)約時(shí)間和能源的角度考慮,在工業(yè)生產(chǎn)中,選定最佳的水解時(shí)間為4h。

圖1 水解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of time on the degree of hydrolysis

2.1.2 pH對(duì)酶解過程的影響 pH對(duì)水解度的影響如圖2所示,可以看出,當(dāng)酶解反應(yīng)pH為7.5時(shí),棉籽蛋白的水解度最高,其他pH的水解度比pH7.5時(shí)略低,因此認(rèn)為pH7.5是水解的最佳值。pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響是多方面的,包括pH對(duì)反應(yīng)底物以及酶的解離狀態(tài)的影響,pH對(duì)酶的構(gòu)象變化的影響,構(gòu)象變化可能使酶失活、酶活性變化。而不同的酶對(duì)不同底物一般都有一個(gè)最佳的pH作用范圍,在這個(gè)作用范圍內(nèi)酶的催化活性部位含有的可解離的基團(tuán)得到了最充分的解離,使酶的活性中心與蛋白質(zhì)底物充分結(jié)合,從而將底物最大程度地轉(zhuǎn)化為水解產(chǎn)物,使水解度達(dá)到最大值,pH偏高偏低都會(huì)導(dǎo)致水解度的下降[11]。

圖2 pH對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of pH value on the degree of hydrolysis

2.1.3 溫度對(duì)酶解過程的影響 由圖3可知,棉籽蛋白水解效果并不隨溫度升高而增加,而是當(dāng)溫度為40℃時(shí)水解度最高,因此40℃為最佳酶解溫度。溫度對(duì)于酶解反應(yīng)的影響主要包括兩個(gè)方面:溫度對(duì)酶的穩(wěn)定性的影響,即熱變性失活,過高的溫度會(huì)使酶失活,圖3中可以看到當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí),水解度降低；溫度對(duì)酶促反應(yīng)本身的影響,在20～40℃之間,升高溫度可以促進(jìn)酶的反應(yīng)[12]。

圖3 溫度對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of temperature o the degree of hydrolysis

2.1.4 酶與底物濃度比(E/S)對(duì)酶解過程的影響 從圖4看出,隨著E/S的加大,水解度不斷的增大。當(dāng)E/S為10000U/g時(shí),棉籽蛋白水解度最高,當(dāng)E/S從2000U/g增加到6000U/g時(shí),水解度從33.07%±1.2%增加到48.07%±0.45%,增加了15%。而當(dāng)E/S從6000U/g增加到10000U/g時(shí),水解度僅增加了4.07%。考慮到食品加工過程中成本等問題,因此選定最佳E/S為6000U/g。

表3 二次多項(xiàng)模型方差分析表Table 3 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

圖4 E/S對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of E/S on the degree of hydrolysis

2.2風(fēng)味蛋白酶水解棉籽蛋白響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析

2.2.1 多元二次模型方程的建立及檢驗(yàn) 風(fēng)味蛋白酶水解棉籽蛋白的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行了17組實(shí)驗(yàn),其中5組中心點(diǎn)重復(fù),結(jié)果見表2。利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到風(fēng)味蛋白酶水解棉籽蛋白的回歸方程如下:

DH=47.70+8.55A-0.73B+3.99C+3.18A2-8.64B2-0.64C2-0.76AB-3.08AC-3.64BC

表2 Box-Bchnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and the experimental result

對(duì)上述方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明(見表4),在風(fēng)味蛋白酶水解棉籽蛋白過程中,溫度(A)、水解時(shí)間(C)均對(duì)水解度有顯著影響；AC、BC的交互作用影響也顯著,即水解過程中,溫度和水解時(shí)間,pH和水解時(shí)間之間的交互作用也對(duì)水解度造成顯著影響。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Regression coefficients and their significance of the quadratic model

注:*表示在5%的水平內(nèi)顯著(0.01

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 通過上述二次多項(xiàng)回歸方程作響應(yīng)曲面圖及其等高線圖見圖5～圖7。通過該組動(dòng)態(tài)圖即可對(duì)任何兩因素交互影響水解度效應(yīng)進(jìn)行分析與評(píng)價(jià),并從中確定最佳因素水平范圍。極值條件出現(xiàn)在等高線的圓心處,等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小,圓形表示兩因素交互作用不顯著,而橢圓形則與之相反[16]。

圖5表明了溫度和pH對(duì)水解度的交互作用,由圖可知,等高線中心的形狀呈圓形,說明了溫度和pH之間的交互作用不顯著。當(dāng)溫度不變時(shí),水解度隨著pH的增大而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)水解pH不變時(shí),水解度隨著溫度的增大而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),溫度上升到一定值,水解度的變化趨于平緩。

圖5 溫度和pH交互影響水解度的曲面圖及其等高線圖Fig.5 Response surface plot and its corresponding contour plot for the effects of variables on the degree of hydrolysis versus temperature and pH

圖6表明了溫度和水解時(shí)間對(duì)水解度的交互作用,由圖可知,等高線的形狀呈橢圓形,說明了溫度和水解時(shí)間之間的交互作用顯著。當(dāng)溫度不變時(shí),水解度隨著時(shí)間的增大而不斷地增大,這和前面的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互吻合；當(dāng)水解時(shí)間不變時(shí),水解度隨著水解溫度的增大而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。

圖6 溫度和時(shí)間交互影響水解度的曲面圖及其等高線圖Fig.6 Response surface plot and its corresponding contour plot for the effects of variables on the degree of hydrolysis versus temperature and time

圖7表明了pH和水解時(shí)間對(duì)水解度的交互作用,由圖可知,因?yàn)槠涞雀呔€呈橢圓形,說明了pH和水解時(shí)間的交互作用比較顯著。當(dāng)pH不變時(shí),棉籽蛋白的水解度隨著水解時(shí)間的增大而上升,當(dāng)水解時(shí)間不變時(shí),棉籽蛋白的水解度隨著酶解pH的增加而呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。

圖7 pH和時(shí)間交互影響水解度的曲面圖及其等高線圖Fig.7 Response surface plot and its corresponding contour plot for the effects of variables on the degree of hydrolysis versus pH and time

2.2.3 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程,利用Design Expert 8.0軟件獲得了水解度最高時(shí)的各個(gè)因素的最佳水解條件為:溫度為50℃,pH為7.45,水解時(shí)間4.14h,水解度可達(dá)到59.64% 。

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性,在模型給出的最佳水解條件下進(jìn)行水解,做三組平行實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果分別為59.95%,58.27%,58.81%,平均值為59.01%±0.81%,與理論計(jì)算值的誤差在±1%以內(nèi),可見該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際水解情況。

3 結(jié)論

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn),確定了風(fēng)味蛋白酶水解棉籽蛋白的最佳酶解溫度為40℃、酶解時(shí)間為4h、pH為7.5和E/S為6000U/g。在此基礎(chǔ)上,以水解度為最終評(píng)價(jià)指標(biāo),通過Box-Benhnken響應(yīng)面分析法對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解棉籽蛋白的水解條件進(jìn)行優(yōu)化,經(jīng)方差分析得知,反應(yīng)溫度、水解時(shí)間對(duì)水解度的影響是顯著的,pH對(duì)水解度的影響不顯著,溫度和水解時(shí)間,pH和水解時(shí)間之間的交互作用也對(duì)水解度造成顯著影響。模型經(jīng)過優(yōu)化得出最佳的水解條件為:溫度為50℃,pH為7.45,水解時(shí)間4.14h,水解度可達(dá)到59.64%,而經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得到的實(shí)際值的平均值為59.01%±0.81%,理論值與實(shí)際值相差不大。實(shí)驗(yàn)證明,響應(yīng)面分析法可以有效地對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解棉籽蛋白的工藝進(jìn)行優(yōu)化,這對(duì)進(jìn)行生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的指導(dǎo)意義。

[1]陳仁,張美華.棉花副產(chǎn)品的綜合利用[M].北京:科學(xué)普及出版社,1986:28-38.

[2]于繼兵,高艷鋒,張東方,等.棉籽蛋白多肽的制備及對(duì)DPPH自由基的清除作用[J].食品研究與開發(fā),2008,29(6):5-8.

[3]劉軍.棉籽蛋白的制備及其酶解物抗氧化與ACE抑制活性的研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文,2009.

[4]高丹丹. 棉籽抗氧化肽和ACE抑制肽的研究[D].南昌:南昌大學(xué)博士論文,2010.

[5]Dandan Gao,Haixing Li,Yusheng Cao. ACE inhibitory activities of peptide fractions derived from cottonseed protein hydrolysate[J]. African Journal of Biotechnology,2010,53(9):8977-8983.

[6]Dandan Gao,Haixing Li,Yusheng Cao. Antioxidant activity of peptide fractions derived from cottonseed protein hydrolysate[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2010,90(11):1855-1860.

[7]常通. 棉籽蛋白發(fā)酵制備ACE抑制肽[D]. 南昌:南昌大學(xué)碩士論文,2011.

[8]羅鵬,王越,李雅婷,等.堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶協(xié)同對(duì)葵花籽蛋白水解度和苦味值的影響[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械,2013(9):41-44.

[9]何照范,張迪清. 保健食品化學(xué)及其檢測(cè)技術(shù)[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1997:141-142.

[10]王霞,蘇秀榕,丁進(jìn)鋒,等.響應(yīng)面法優(yōu)化雙酶水解黃鰭金槍魚胰臟的工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技,2010,26(11):1229-1233.

[11]劉晶晶,黃婷,顧云,等. 可控酶解河蜆蛋白質(zhì)的工藝優(yōu)化[J].食品科技,2013,38(1):109-113.

[12]張俊英,王彩云,靳燁,等. 酶水解乳清蛋白工藝條件的研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工,2009(6):35-37.

[13]Haixing Li,Ting Qiu,Dandan Gao,etal. Medium optimization for production of gamma-aminobutyric acid by Lactobacillus brevis NCL912[J]. Amino Acids,2010,38:1439-1445.

[14]陳飛平,周家華,常虹,等.響應(yīng)面法優(yōu)化酶解莧籽蛋白制備ACE抑制肽工藝[J].食品科學(xué),2013,34(19):254-260.

[15]孔令明,勞斐,李芳,等.響應(yīng)面法優(yōu)化杏仁ACE抑制肽的酶解工藝研究[J].中國食品添加劑,2013(1):130-136.

[16]王曉陽,唐琳,趙壘.響應(yīng)面法優(yōu)化刺槐花多酚的超聲提取工藝[J].食品科學(xué),2011,32(2):66-69.

Optimization of conditions of cottonseed protein hydrolyzed by flavourzyme using response surface methodology

GAODan-dan,QIGao-zhan*,GUOPeng-hui

(College of Life Science and Engineering,Northwest University for Nationalities,Lanzhou 730030,China)

Cottonseed protein was hydrolyzed by Flavourzyme. The influences of the substrate/enzyme ratio,hydrolysis time,pH value and temperature on the degree of hydrolysis of cottonseed protein were investigated. On the basis of single factor tests,the best possible extraction parameters were obtained with the response surface methodology(RSM),at a three-variable,three-level experiment Box-Behnken design(BBD). The optimum hydrolysis parameters were as follows:when the substrate/enzyme ratio was 6000U/g,the cottonseed protein was hydrolyzed for 4.14 hours at temperature 50℃ under pH 7.45,and the degree of hydrolysis was reached 59.01%±0.81%.

enzymatic hydrolysis;cottonseed protein;response surface methodology;flavourzyme

2014-02-19 *通訊聯(lián)系人

高丹丹(1983-)，女，博士，副教授,研究方向：食品生物技術(shù)。

國家自然科學(xué)基金計(jì)劃(31360375)；甘肅省青年科技基金計(jì)劃(1107RJYA018)；西北民族大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(31920130046)。

TS255.1

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001