β-聚蘋果酸/殼聚糖-硝苯地平微膠囊的制備研究

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(上海應用技術學院 香料香精技術與工程學院,上海 201418)

β-聚蘋果酸/殼聚糖-硝苯地平微膠囊的制備研究

王風樓,吳艷麗,王文揚,馬霞*

(上海應用技術學院 香料香精技術與工程學院,上海 201418)

目的:將聚蘋果酸(poly malic acid,PMLA)與殼聚糖(CS)發生復凝聚形成微膠囊并對藥物硝苯地平進行包埋,制得粒度均一的微膠囊顆粒。方法:根據預實驗確定添加順序和范圍,進行Plackette-Burman實驗選擇影響較強的幾個因素,根據(Box-Behnken設計)正交設計得到最優的制備條件。結果:根據實驗得出,當條件為β-聚蘋果酸濃度1.0g/L、殼聚糖濃度0.5g/L、β-聚蘋果酸與殼聚糖溶液體積比2∶1、殼聚糖pH4.0、硝苯地平溶液濃度1.0g/L、硝苯地平添加量3.0mL、β-聚蘋果酸溶液滴加速度10.0mL/h、攪拌速度600r/min、體系反應時間45min,所得微膠囊平均粒徑525.6nm,平均分散系數0.186.

β-聚蘋果酸,殼聚糖,微膠囊,Plackette-Burman,Box-Behnken

聚蘋果酸(poly malic acid,PMLA)是一類生物高分子化合物,由唯一單體L-蘋果酸通過酯鍵聚合而成的水溶性脂肪族聚酯化合物[1],主要有α型,β型和γ型3種結構[2],而存在于生物體內的只有β型。PMLA具有良好的生物相容性、生物可降解性以及極好的水溶性[3]。β-聚蘋果酸具有特殊結構,其大量游離的羧基較易被修飾,可與藥物等分子的活性基團結合,作為藥物載體及微膠囊材料使用[4]。硝苯地平是二氫吡啶類鈣拮抗劑,降壓作用強而迅速,聚蘋果酸帶負電荷,能夠通過復凝聚法與陽離子化合物發生聚合形成微膠囊,對硝苯地平進行包埋,從而使其發揮長效并得到緩釋。

圖1 聚蘋果酸的結構式Fig.1 The molecular structures of poly malic acid

1 材料與方法

1.1材料與儀器

聚蘋果酸(PMLA,)實驗室自制,殼聚糖(CS)Shanghai plus Bio-Sci &Tech Co. Ltd,硝苯地平 實驗室提供,醋酸、NaOH、無水乙醇等 國藥集團化學試劑有限公司。

定式恒溫磁力攪拌器Feb-94 上海閔行虹譜儀器廠；電子天平 YP1002N 上海精科；冷凍離心機L-530 長沙湘儀離心機儀器廠；納米激光粒度儀 Zetasizer Nano ZS型 英國馬爾文儀器有限公司;pH計 FE20 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；冷凍恒溫振蕩器DHZ-D 太倉市實驗設備廠；725型-紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2實驗方法

發酵制備聚蘋果酸[5-7],由于β-聚蘋果酸帶負電荷,殼聚糖帶正電荷,β-聚蘋果酸與殼聚糖發生復凝聚反應,對硝苯地平進行包裹形成藥物微膠囊[8-9]。用納米激光粒度儀對制得的微膠囊水溶液進行微膠囊粒度的測定。通過預實驗選擇整個工藝的基本路線,并通過PB實驗選出3～4個影響最強的因素,然后通過Box-Behnken選出最優的工藝。

1.2.1 預實驗 包括兩部分,分別為殼聚糖溶液pH范圍的確定和微膠囊兩種壁材—β-聚蘋果酸、殼聚糖與芯材(硝苯地平)添加順序的確定。

1.2.1.1 殼聚糖溶液pH范圍的確定 取7支干燥潔凈的試管標號1～7,分別加入2mL的殼聚糖溶液,用1mol/L的鹽酸溶液和1mol/L的氫氧化鈉溶液調節殼聚糖的酸堿度,得到pH為2～8的梯度,觀察有無沉淀。在上面未產生沉淀的試管中各加入1mL的β-聚蘋果酸溶液,觀察有無沉淀產生,記錄現象。1.2.1.2 添加順序的確定:選擇壁材為20mL的反應體系,取PMLA濃度為1mg/mL,CS濃度為1mg/mL,pH為4,PMLA∶CS=1∶1,藥物濃度為0.5mg/mL,添加量為1mL；三次添加順序實驗設計為:1:a,b,c；2:c,a,b；3:b,a,c。其中:1、2、3為實驗號,a為5mL硝苯地平,b為10mL殼聚糖,c為10mL β-聚蘋果酸。在磁力攪拌器上攪拌,并通過納米激光粒度儀對反應后的均勻液相進行微膠囊粒度測定,觀察膠囊的粒徑及其分散系數,確定實驗時三種材料的添加順序。

根據預實驗得出:將硝苯地平加入到CS中,攪拌均勻,然后將PMLA溶液緩慢滴加到CS/硝苯地平混合液中,滴加完結后反應半小時,測定粒徑均一,分散系數較小,包埋效果較好。

1.2.2 Plackett-Burman實驗 因微膠囊制備過程中的影響因素較多,需先確定主要影響因素,因此通過design軟件設計Plackett-Burman實驗確定主要影響因素[10]。在預實驗的基礎上選擇最優添加順序,選取可能產生影響的諸多因素,對PMLA的濃度,CS的濃度,PMLA/CS的比值,硝苯地平的濃度,硝苯地平的添加量,CS的pH,攪拌速度,滴加速度,反應時間進行考察。表中1表示每個因素最高實驗值所對應的水平,-1代表每個因素最低實驗值所對應的水平。

1.2.3 Box-Behnken實驗 在PB實驗的基礎上,選取較佳的因素和水平,采用響應面分析法對微膠囊制作條件進行優化,獲取最佳工藝參數,根據Box-Behnken中心組合實驗設計原理[11],選擇影響較強的3～4個因素,對其進行響應面設計,分析并選取最優的工藝。

表1 Plackett-Burman設計因素水平Table 1 The levels of various factors in Plackett-Burman design

注:實驗中PMLA和殼聚糖的體積均為10mL。

表2 Box-Behnken設計因素水平Table 2 The levels of various factors in Box-Behnken Design

2 結果與討論

2.1預實驗結果

在調節殼聚糖溶液pH的過程中,滴加1mol/L的氫氧化鈉,試管中會有白色片狀沉淀產生,搖勻后溶液變澄清,當pH為7.0時,試管中懸浮有大量白色片狀沉淀,添加一組pH為6.5的殼聚糖溶液,試管中仍然懸浮有大量片狀白色沉淀,確定殼聚糖溶液pH應小于6.0。向1～5號管中滴加β-聚蘋果酸溶液,發現1～3號有沉淀產生,4號沒有。為進一步確定殼聚糖溶液pH,添加pH4.1～4.9的殼聚糖溶液,pH大于4.5,沒有沉淀。預實驗結果表明殼聚糖用于制備β-聚蘋果酸/殼聚糖微膠囊使用的殼聚糖溶液的pH范圍為2.0～4.5。

表3 預實驗結果Table 3 The results of pre-experiment

本次實驗是制備β-聚蘋果酸/殼聚糖納米微膠囊,因此要求制備出的微膠囊粒徑小且分散均勻。由表3實驗數據比較可知,納米激光粒度儀測出實驗3微膠囊粒徑最小且粒徑分散均勻。因此,確定β-聚蘋果酸/殼聚糖微膠囊的兩種壁材和芯材的添加順序為,先加入殼聚糖和硝苯地平溶液,攪拌混勻后,再滴加β-聚蘋果酸溶液。

2.2 Plackett-Burman實驗結果

根據PB實驗結果進行分析,如表4和表5。

表4 Plackett-Burman實驗設計結果Table 4 The results of Plackett-Burman design

注:兩種壁材的總體積,反應總體積。

表5 以微膠囊粒徑為指標的方差分析表Table 5 The variance analysis of microcapsule particle size

由表4和表5的結果可以看出,因素p(A)=0.002,p(G)=0.0214,兩者p<0.05,表明β-聚蘋果酸溶液的濃度和攪拌速度對微膠囊的粒徑有顯著影響,且β-聚蘋果酸溶液的濃度影響最顯著,攪拌速度次之。根據D-E軟件分析結果顯示粒徑的回歸方程為:

Y=369.85-209.08A+62.77C-35.30D-18.97F-106.92G+57.65H+66.70J,從方程上可知,增加β-聚蘋果酸溶液的濃度、硝苯地平溶液的濃度、殼聚糖溶液的pH、攪拌速度可以減小微膠囊的粒徑,而增加β-聚蘋果酸與殼聚糖溶液的體積比、體系的反應時間、β-聚蘋果酸的滴加速度會增加微膠囊的粒徑。

2.3 Box-Behnken實驗結果

Box-Behnken結果分析[12-13],根據上述PB實驗可知,β-聚蘋果酸溶液的濃度影響最顯著,且增加β-聚蘋果酸溶液的濃度、硝苯地平溶液的濃度可以減小微膠囊的粒徑,取β-聚蘋果酸濃度1.0g/L,硝苯地平1.0g/L；根據實際操作取殼聚糖0.5g/L,殼聚糖pH4.0,β-聚蘋果酸/殼聚糖為2∶1,壁材總量為15mL,總反應體系為20mL,設計響應面的實驗結果如表6。

用Design Expert軟件得到的分析結果,微膠囊粒徑的回歸方程為:

Y=592.44-153.97X1+11.59X2-5.65X3+74.43X4-9.58X1X2-38.90X1X3-71.90X1X4-22.60X2X3-337.85X2X4-23.35X3X4+63.58X12+168.75X22-1.96X32+241.77X42

上式中,Y為微膠囊粒徑(nm),X1、X2、X3、X4分別為滴加速度(mL/h)、藥物添加量(mL)、攪拌速度(r/min)、反應時間(min),該模型R2=0.7640。由表7可知,回歸方程模型顯著(p<0.05),因此這種實驗方法可靠。模型失擬項不顯著(p>0.05),表明該模型穩定。

表6 Box-Behnken實驗設計結果Table 6 The results of Box-Behnken design

注:兩種壁材的總體積為,反應總體系為20mL。

表7 粒徑的二次模型方差分析Table 7 Particle size of two model analysis of variance

從表8可知,各因素對微膠囊粒徑的影響程度從大到小依次為滴加速度、反應時間、藥物添加量和攪拌速度。滴加速度影響程度尤為顯著(p=0.0080),達到顯著水平,反應時間、藥物添加量和攪拌速度對微膠囊粒徑的影響不顯著(p>0.05)。

表8 粒徑的二次模型回歸方程系數顯著性檢驗Table 8 The particle diameter of the two model test of significance for the regression coefficients

注:CV=21.94%,Adeq Precisior=7.628,Std.Dev=172.82,p<0.05說明顯著。

通過Design Expert軟件對響應面實驗數據的計算,得到最優條件組合為:PMLA滴加速度10.0mL/h,藥物添加量3mL,攪拌速度600r/min,反應時間43.23min。在此條件下,可以得到粒徑468.8nm微膠囊。為了實驗方便,取PMLA滴加速度10.0mL/h,藥物添加量3mL,攪拌速度600r/min,反應時間45min,時驗證回歸模型的有效性,根據得到的最優條件,做三組平行實驗,得到最優制備條件下微膠囊的平均粒徑為525.6nm,平均分散系數為0.186。結果表明,實際測量值525.6nm與預測值接近,說明模型是合理有效的且具有一定的實際指導意義。

3 結論

利用統計學的方法建立了制作PMLA-殼聚糖微膠囊的多項式數學模型。通過模型進行分析,獲得影響微膠囊粒徑和體系分散系數的最佳條件,并利用模型方程對其進行預測。結果表明:β-聚蘋果酸溶液的濃度和攪拌速度對微膠囊的粒徑有顯著影響,且PMLA濃度影響最顯著,攪拌速度次之。制備β-聚蘋果酸微膠囊的最佳工藝條件為:PMLA濃度1.0g/L、殼聚糖濃度0.5g/L、PMLA與殼聚糖溶液體積比2.0、殼聚糖pH4.0、攪拌速度600r/min、硝苯地平溶液濃度1.0g/L、藥物添加量3.0mL,PMLA滴加速度10.0mL/h,反應時間45min,并測定了在最優制備條件下微膠囊的平均粒徑為525.6nm,平均分散系數為0.186,包埋率為43.0%,載藥量為6.23%。

微膠囊作為一種新穎的控釋給藥體系,根據不同需要設計藥物的最佳釋放時間、釋放速度,及延長藥物作用的時間、降低給藥劑量、降低藥物的許多毒副作用等優點,近年來受到了許多學者的關注。利用天然的或合成的高分子材料將固態藥物或液態藥物溶解或分散在高分子材料,形成微膠囊體系,能夠延緩釋放、提高穩定性,降低毒副作用[14],而β-聚蘋果酸作為一種新型的高分子生物材料,其降解產物沒有毒害作用,可作為藥物載體及微膠囊材料,具體廣泛的應用前景。

[1]Shimada K,Matsushima K,Fukumoto J,etal. Poly-L-malic acid:a new protease inhibitor from Penicillium cuclopium[J]. Biochem BiopHys Res Commun,1969,35(5):619-624.

[2]Nagata N,Nakahara T,Tabachi T. Fermentative production of poly(β-malic acid),a poly electrolytic biopolyester,by Aureobasidium sp[J]. Biosci Biotech Biochem,1993,57(4):638-642.

[3]李睿穎,徐勤虎,劉曉鷗等. 聚蘋果酸及其衍生物的研究與發展[J]. 食品工程,2009,(2):6-9.

[4]吳艷麗,馬霞,俞鴻千. β-聚蘋果酸/明膠微膠囊的制備[J]. 食品工業科技,2013,(34)15:234-237.

[5]Carolin Goedde,Matthias Liebergesell. Alexander Steinbuchel.Isolation of poly(13-L-malic acid)-degrading bacteria and purification and characterization of the PMA hydrolase from Comamonas acidovorans strain 7789[J]. FEMS Microbiology Lett,1999,173:365.

[6]Toshiaki Nakajima-Kambe,Naoko Hirotani,Tadaatsu Nakahara. Poly(β-Malic Acid)production by the non-growing cells of Aureobasidium sp. Strain A-91[J]. Fermentation and Bioengineering,1996,82(04):441.

[7]劉雙江. 出芽短梗霉菌株CBS591175 和DSM2404發酵生產聚蘋果酸的研究[J]. 生物工程學報,1997,13(3):279-283.

[8]高艷,歐陽建勛,謝定,等. 復合凝聚法設備辣椒素微膠囊的研究[J]. 糧食科技與經濟,2011,36(5):51-53.

[9]Zsolt Keresztessy,Magdolna Bodnár,Elizabeth Ber,etal. elfassembling chitosan/poly-γ-glutamic acid nanoparticles .for targeted durg delivery[J]. Colloid Polym Sci,2009,28(7):759-765.

[10]徐向宏,何明珠.《實驗設計與Design-Expert、SPSS應用》. 北京:科學出版社,2010:146-160;194-204.

[11]鞠蕾,馬霞. γ-聚谷氨酸的生物合成及其納米膠囊的制備[D]. 上海:上海應用技術學院,2012:21-23.

[12]劉建峰,葛向陽,梁云祥. 響應面法優化豆粕固態發酵工藝的研究[J]. 中國生物工程雜志,2007,27(6):87-91.

[13]代文亮,程龍,陶文沂. 響應面法在紫杉醇產生菌發酵前提優化中的應用[J]. 中國生物工程雜志,2007,27(11):66-72.

[14]田燕,于蓮.《藥劑學》. 北京:清華大學出版社,2011:321-345.

Application of poly malic acid/Chitosan-Nifedipine in producting microcapsules

WANGFeng-lou,WUYan-li,WangWen-yang,MAXia*

(School of Perfume and Aroma Technology,Shanghai Institute of Technology,Shanghai 201418,China)

Objective:With β-poly malic acid and Chitosan as the coating materials,complex coagulation method was chosen to encapsulate Nifedipine into microcapsules of uniform particle size. Methods:According to the pre-experiment the order and the amount of addition was defined through the Plackett-Burman(PB)experimentals and related factors in the evaluation,screening the remarkable effect factors,and then the optimum preparative conditions were obtained from orthogonal design of experiment(designed by Box-Behnken). Conclusion:The optimized preparation of sustained-release fragrance conditions were:the concentration of β-poly malic acid was 1.0g/L,the concentration of chitosan was 0.5g/L,β-poly malic acid and chitosan solution volume ratio was 2∶1,the pH value of chitosan was 4.0,the concentration of Nifedipine solution was 1.0g/L,nifedipine added to 3.0mL,β-poly malic acid solution dropping acceleration was 10.0mL/h,the stirring speed was 600r/min,the reaction time was 45min,the microcapsules of average particle diameter was 525.6nm and the average dispersion coefficient was 0.186.

β-poly malic acid(PMLA);Chitosan;microcapsules;Plackette-Burman;Box-Behnke

2013-12-24 *通訊聯系人

王風樓(1988-),女,研究生,研究方向:生物化工。

上海市科委重點項目(10540501100)。

TS201.2

B

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001