實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)羊肉中雞源性成分的量化檢測(cè)

，，， ，， ，，

(北京市食品安全監(jiān)控中心，北京 )

實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)羊肉中雞源性成分的量化檢測(cè)

薛晨玉，趙琳娜，楊紅蓮，玉丹，宋麗萍，郭淼，楊昕霆，胡智愷

(北京市食品安全監(jiān)控中心，北京 )

為實(shí)現(xiàn)羊肉中雞源性成分的量化檢測(cè),本文利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù),通過在單拷貝基因上設(shè)計(jì)引物,DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制以及確定羊肉,雞肉質(zhì)量與DNA數(shù)學(xué)換算參數(shù)等方法,對(duì)四種不同摻混比例的雞肉、豬肉混合樣本摻混的質(zhì)量百分比進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,檢測(cè)百分比與理論混合百分比間的絕對(duì)誤差控制在5%以內(nèi),量化研究結(jié)果準(zhǔn)確,該法為食品安全檢測(cè)工作提供了技術(shù)支撐。

肉類摻假,量化研究,實(shí)時(shí)熒光PCR

近年來(lái),許多不法商販?zhǔn)褂脙r(jià)格較低的豬肉,雞肉,鴨肉加入調(diào)味劑冒充牛羊肉制品,或?qū)⒇i、雞、鴨肉摻入牛羊肉中販賣[1],這種行為嚴(yán)重?cái)_亂了市場(chǎng)秩序,侵害了消費(fèi)者利益。因此,對(duì)肉類安全的監(jiān)管非常重要,尋找一種有效鑒定肉類摻假的技術(shù)手段成為當(dāng)務(wù)之急。

目前肉類摻假的檢測(cè)方法主要有兩種,一種是以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的方法[2],如色譜法,質(zhì)譜法[3],蛋白質(zhì)組學(xué)法[4]與酶聯(lián)免疫分析法[5]等,另一種是以DNA為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法[6-9],DNA熱穩(wěn)定性較強(qiáng),不易隨加工變性分解,是目前食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的常用方法[10-14]。在肉類檢測(cè)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中通常采用Taqman探針法[15],根據(jù)線粒體DNA設(shè)計(jì)引物和探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16-17]。由于線粒體DNA普遍存在于各種肉類組織中,且拷貝數(shù)明顯高于基因組DNA,所以這種方法靈敏性高[18],可檢測(cè)肉類樣品中微量的外源污染[19]。另外,由于線粒體在不同細(xì)胞中的含量存在差異,因此這種方法只能對(duì)肉類摻假進(jìn)行定性檢測(cè)而不能量化,無(wú)法區(qū)分肉樣是污染還是摻假,更不能知曉其摻假比例。因此,肉類摻假的量化研究十分必要。

與線粒體相比,一些看家基因的DNA拷貝數(shù)低,組織間差異不大[20],有利于進(jìn)行量化分析。本文采用雞肉和羊肉作為實(shí)驗(yàn)樣本,從基因組單拷貝DNA上設(shè)計(jì)特異性引物和探針,并通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的和確立基因質(zhì)量比系數(shù),實(shí)現(xiàn)對(duì)生鮮羊肉中摻有雞肉的比例進(jìn)行定量檢測(cè),為肉類摻假量化研究的進(jìn)一步發(fā)展提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1原料與儀器

實(shí)驗(yàn)所用樣品為精瘦羊肉及精瘦雞肉,購(gòu)于北京市石景山區(qū)物美大賣場(chǎng)(西黃村店)?；旌先鈽又苽涞谋壤?羊肉:雞肉)為:20%:80%；40%:60%；60%:40%；80%:20%。

熒光PCR試劑(premix Ex TaqTM)購(gòu)于TAKARA公司；其它常用試劑均是國(guó)產(chǎn)試劑。

3K18 離心機(jī) 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；MyiQ單色實(shí)時(shí)定量PCR儀 購(gòu)自美國(guó)伯樂公司；核酸測(cè)定儀(Eppendorf Biophotometer Plus) 購(gòu)自Eppendorf公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 DNA提取方法如圖1所示。

圖1 DNA提取方法流程圖Fig.1 The flow chart of the DNA extraction method

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線以lg DNA含量為橫坐標(biāo),以實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的Ct值為縱坐標(biāo)繪制,雞源性和標(biāo)羊源性DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為:50、100、150、200、250、300、350ng。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增

1.2.3.1 引物和探針 所有的引物和探針均由賽百盛生物公司合成。引物和探針序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的引物和探針列表Table 1 The sequence of primers and probe

表2 引物與探針的DNA擴(kuò)增特異性驗(yàn)證Table 2 The DNA amplification results for testing the primers and probe

注:表中DNA濃度為三次實(shí)驗(yàn)的平均值。N/A為40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增中未檢測(cè)到熒光值。1.2.3.2 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系 反應(yīng)體系為20μL,其中2×Premix Ex Taq(Takara)10μL,探針1μL(10pmol/μL),上、下游引物各0.5μL(10pmol/μL),模版DNA 2μL。

1.2.3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增條件 95℃ 30s；95℃,。以無(wú)菌水代替模板DNA作為空白對(duì)照。

1.2.3.5 數(shù)據(jù)計(jì)算方法 在本實(shí)驗(yàn)中M羊/M雞=(d羊×DNA羊)/(d雞×DNA雞)(公式1)進(jìn)行計(jì)算,其中d=M/DNA

2 結(jié)果與分析

2.1引物及探針的特異性檢測(cè)

對(duì)所有引物進(jìn)行特異性檢驗(yàn),以確保熒光實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)反應(yīng)的準(zhǔn)確性。分別以雞、鴨、羊、牛、豬、狗、貓、鼠的DNA為模板,用1.2.3的方法進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果如圖1所示。羊源性與雞源性DNA的熒光PCR擴(kuò)增Ct值與LgDNA含量之間均呈現(xiàn)線性關(guān)系,其函數(shù)關(guān)系式分別為:羊源性:y=-3.387x=35.46；雞源性:y=-3.366x=33.87。其中y為Ct值,x為L(zhǎng)gDNA含量。結(jié)果證明,表1中的引物均具有高度的擴(kuò)增特異性(如表2所示)。

2.2相同質(zhì)量的雞肉和羊肉所提出的DNA濃度差異

目前國(guó)際上,通過熒光PCR法進(jìn)行的肉類定量檢測(cè)多以DNA定量為主,尚未有報(bào)道分析肉類的質(zhì)量與DNA含量之間的關(guān)系,量化研究未進(jìn)入到質(zhì)量水平。不同物種的瘦肉中DNA的含量不同是長(zhǎng)期影響肉類定量研究的一個(gè)關(guān)鍵問題,為尋找出不同種類肉樣質(zhì)量與DNA含量之間的關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)分別取0.10g和0.05g的雞肉和羊肉,按照?qǐng)D1的方法提取DNA并測(cè)定濃度,結(jié)果如表3所示。

當(dāng)提取0.1g羊肉樣本時(shí),M羊/DNA羊的值為3.1×10-4；當(dāng)提取0.05g羊肉樣本時(shí),M羊/DNA羊的值為3.3×10-4。當(dāng)提取為0.1g雞肉時(shí),M雞/DNA雞的本文認(rèn)為DNA濃度與樣品質(zhì)量的比值,在樣品被充分破碎且保持相同提取方法的情況下,該值是由肉自身的特性決定的,與取樣質(zhì)量無(wú)關(guān),其中不同質(zhì)量時(shí),M/DNA的比值差異可能是由于操作誤差或者儀器檢測(cè)誤差造成。本研究中,設(shè)d=M/DNA(d取兩個(gè)不同質(zhì)量實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值)。由上述數(shù)據(jù)可以得出混合肉樣質(zhì)量比值與DNA比值的換算公式。

表4 混合肉樣中豬肉和羊肉含量的定量檢測(cè)Table 4 Values measured by sheep and chicken of the sample 1-4

注:表中擴(kuò)增結(jié)果(Ct)為三次實(shí)驗(yàn)的平均值。值為1.7×10-4,當(dāng)提取0.05g雞肉時(shí),M雞/DNA雞的值為2.3×10-4。

表3 相同質(zhì)量豬肉和羊肉所提DNA的濃度Table 3 The DNA concentration extracted in the same quality of sheep and chicken

注:表中DNA濃度為三次實(shí)驗(yàn)的平均值,d=M/DNA

2.3雞肉和羊肉DNA擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

為使用熒光實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)樣品中羊肉和雞肉的質(zhì)量百分比,有必要繪制雞肉和羊肉的DNA擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2 羊源性DNA與雞源性DNA的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The DNA amplification standard curve 注:A為DNA擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線,B為DNA擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4檢測(cè)混合肉樣中雞肉和羊肉的所含比例

本實(shí)驗(yàn)中羊肉樣本和雞肉樣本的混合比例見表4。

1、2、3和4號(hào)樣品的基因組DNA均按照?qǐng)D1中方法提取并作為熒光實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)的模板,按照方法1.2.3進(jìn)行PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值見于表4(擴(kuò)增結(jié)果)。將Ct值帶入羊肉和雞肉各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線中:羊y=-3.387x+35.46；雞y=-3.366x+33.87,計(jì)算出樣品中所含有的相應(yīng)物種的DNA含量:DNA羊及DNA雞。根據(jù)公式1計(jì)算樣品中相應(yīng)物種在樣品質(zhì)量中所占的百分比,即:M羊/M雞=(d羊×DNA羊)/(d雞×DNA雞),結(jié)果見表4(檢測(cè)混合比例)。通過檢測(cè)結(jié)果與理論值對(duì)照我們發(fā)現(xiàn),這種通過熒光實(shí)時(shí)PCR技術(shù)對(duì)混合瘦肉樣品百分含量進(jìn)行定量檢測(cè)的方法,結(jié)果中檢測(cè)百分比與理論混合百分比之間的絕對(duì)誤差控制在5%以內(nèi),量化研究結(jié)果基本準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

本研究通過實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)鮮瘦肉樣本中摻混情況的質(zhì)量百分含量檢測(cè),由于實(shí)驗(yàn)過程中的儀器及操作誤差,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論值之間存在一定的誤差,但是這種誤差小于5%(表4),所得結(jié)果接近理論百分含量,可為實(shí)際監(jiān)管工作提供必需的技術(shù)保障。

在目前國(guó)內(nèi)外基于熒光PCR的肉類定量檢測(cè)方法主要有兩種,其中以利用線粒體基因進(jìn)行探針設(shè)計(jì)的方法較為多見[19]。線粒體基因拷貝數(shù)高,在食品加工的過程中不易分解,在檢測(cè)中具有一定的優(yōu)勢(shì)。但是,線粒體基因存在很大的組織間差異,會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差。另一種方法以基因組上的低拷貝基因?yàn)榘悬c(diǎn)進(jìn)行探針設(shè)計(jì),這種方法有利于消除肉類的組織間差異,使檢測(cè)所得DNA含量與細(xì)胞數(shù)之間具有對(duì)應(yīng)關(guān)系。目前在國(guó)際上,實(shí)現(xiàn)在以上這兩種方法均只能對(duì)肉類的基因含量進(jìn)行定量分析,無(wú)法獲得肉類質(zhì)量的摻混比例,與肉類檢測(cè)工作是實(shí)際需求仍存在著一定的差距。本研究采取在基因組上底拷貝的保守基因上設(shè)計(jì)引物的方法,通過實(shí)時(shí)定量PCR得到的基因含量可以和樣本基因組的含量成正相關(guān),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制可以在基因水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的量化判定。在本研究中,我們使用的樣本為純瘦肉組織,因此,可以通過質(zhì)量含量與DNA含量的數(shù)學(xué)換算關(guān)系,確立質(zhì)量/DNA系數(shù),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中雞肉的質(zhì)量百分含量進(jìn)行鑒定。

本文拓展了實(shí)時(shí)定量PCR在食品安全檢測(cè)方面的應(yīng)用,將低拷貝基因引入到引物設(shè)計(jì)中,實(shí)現(xiàn)了在基因水平上對(duì)肉類產(chǎn)品中的動(dòng)物源性成分進(jìn)行量化判定,以及生鮮精瘦肉的質(zhì)量百分比定量,有利于市場(chǎng)上肉塊,羊肉片摻假的檢驗(yàn)工作,為現(xiàn)實(shí)的監(jiān)管工作提供了有力的技術(shù)保障。

[1]李巧玲,劉景艷. 市場(chǎng)鮮豬肉摻假狀況的調(diào)查監(jiān)測(cè)[J]. 食品科學(xué),2004,25(10):273-276.

[2]馬永征,馬冬,白娣斯,等. 免疫學(xué)檢測(cè)肉類制品摻假研究進(jìn)展[J],肉類研究 2012,26(09):26-29

[3]馮靜,劉琳,黃孟軍,等. 基于飛行時(shí)間質(zhì)譜的快速肉類溯源檢測(cè)方法[C]. 第四屆國(guó)際食品安全高峰論壇 論文集,2011,200-204.

[4]Bendixen E. The use of proteomics in meat science[J]. Meat science,2005,71(1):138-149.

[5]RENCOVA E SI,NECIDOVA I. Identification by ELISA of poultry,horse,kangaroo,and rat muscle specific proteins in heat processed products[J]. Veterinarni Medicina,2000,45(12):353-356.

[6]劉帥帥,李宏,羅世芝. PCR技術(shù)在肉類摻假檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2011,2(6):281-283.

[7]何瑋玲 張馳,楊靜等. 食品中4 種肉類成分多重PCR 的快速鑒別方法[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,45(9):1873-1880.

[8]Rodriguez MA,Garcia T,Gonzalez I,etal. Identification of goose,mule duck,chicken,turkey,and swine in foie gras by species-specific polymerase chain reaction[J]. Journal of agricultural and food chemistry,2003,51(6):1524-1529.

[9]Lopez-Andreo M,Garrido-Pertierra A,Puyet A. Evaluation of post-polymerase chain reaction melting temperature analysis for meat species identification in mixed DNA samples[J]. Journal of agricultural and food chemistry,2006,54(21):7973-7978.

[10]高琳,徐幸蓮,周光宏. PCR技術(shù)用于食品中原料肉物種鑒別的研究進(jìn)展[J].肉類研究,2006,20(10):9-21.

[11]Arana A,Soret B,Lasa I,Alfonso L. Meat traceability using DNA markers:application to the beef industry[J]. Meat science,2002,61(4):367-373.

[12]Ballin NZ,Vogensen FK,Karlsson AH. Species determination-Can we detect and quantify meat adulteration[J]. Meat science,2009,83(2):165-174.

[13]Girish PS,Anjaneyulu AS,Viswas KN,Shivakumar BM,Anand M,Patel M,Sharma B. Meat species identification by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)of mitochondrial 12S rRNA gene[J].Meat science,2005,70(1):107-112.

[14]范麗麗,李培,丁洪流,等. 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)快速檢測(cè)食品中的牛源成分[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(12):65-70.

[15]SN/T 2978-2011. 中華人民共和國(guó)出入鏡檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn):動(dòng)物源性產(chǎn)品中雞源性成分PCR檢測(cè)方法[S]. 北京:中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,2011.

[16]Brodmann PD,Moor D. Sensitive and semi-quantitative TaqMan real-time polymerase chain reaction systems for the detection of beef(Bos taurus)and the detection of the family Mammalia in food and feed[J]. Meat science,2003,65(1):599-607.

[17]Zhang CL,Scott NW,Lawson G,etal. A TaqMan real-time PCR system for the identication and quantication of bovine DNA in meats,milks and cheeses[J]. Food Control,2007,18(9):1149-1158.

[18]Imaizumi K,Akutsu T,Miyasaka S,etal. Development of species identification tests targeting the 16S ribosomal RNA coding region in mitochondrial DNA[J]. International journal of legal medicine,2007,121(3):184-191.

[19]Murugaiah C,Noor ZM,Mastakim M,etal. Meat species identification and Halal authentication analysis using mitochondrial DNA[J]. Meat science,2009,83(1):57-61.

[20]Hopwood AJ,Fairbrother KS,Lockley AK,etal. An actin gene-related polymerase chain reaction(PCR)test for identification of chicken in meat mixtures[J]. Meat science,1999,53(4):227-231.

Real-time PCR method for quantitative detect chicken blending in sheep

XUIChen-yu,ZHAOLin-na,YANGHong-lian,YUDan,SONGLi-ping,GUOMiao,YANXin-ting,HUZhi-kai

( Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment，Beijing 100041，China)

A real-time PCR method was provided for quantitative analysis the chicken blending in pig. The primers which target genes were single copy in genome were designed. A series of genome DNA were used as standard curve in real-time PCR. The mathematical conversion parameters about the mass of meat and DNA were determined. The w/w equivalents of four blending samples were analyzed. The results showed that the absolute error of detection with a tolerance of less than 5%. This research can provide technical support for food safety.

Meat adulteration；Quantitative analysis；Real-time PCR

2013-12-25

薛晨玉(1987-)，碩士，研究方向：食品安全檢測(cè)。

TS

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001