人源化抗肝癌雙鏈抗體納米顆粒對荷人肝癌裸鼠放射免疫顯像研究*

別彩群，梁旭競，湯紹輝，李 萌，孫士敏，范紅梅

肝癌是全球第五大常見的癌癥，占所有癌癥的5.6%。全球每年的新發病例約為 564，000例[1～3]，其中50%以上的肝癌發生在我國。肝癌惡性程度高，總體治療效果差，一般平均生存時間只有3個月左右。傳統的治療肝癌的手段包括外科手術治療、腫瘤局部治療、放射治療、化學抗腫瘤藥物治療以及綜合治療等。盡管治療方面有很多進展，但總體的療效并不理想。因此，探索更有效的診斷和治療方法是目前肝癌研究亟待解決的重點課題之一。 肝癌的分子靶向治療研究有望成為治療肝癌的新手段，其中新型肝癌基因工程抗體作為載體的導向治療是未來肝癌免疫治療的研究熱點。本課題組在前期工作中已成功構建了抗肝癌噬菌體scFv庫，并從中篩選出1株抗肝癌單鏈抗體，命名為 scFv4-16（GenBank登錄號：DQ640759），經體外親和力成熟及初步鑒定，獲得了特異性較強、親和力較高的抗肝癌單鏈抗體scFvDM[4]。我們完成了對該抗體進行人源化改造[5]，構建和表達了單鏈抗體二聚體（又稱雙鏈或雙價抗體），并對其進行了生物活性鑒定，獲得了一株免疫原性低、親和力高、穩定性好、活性高的抗肝癌雙鏈抗體，被命名為BDM3[6]。納米顆粒是通過載藥微粒將治療藥物靶向導向到病灶部位，而對非靶組織、器官、細胞影響很小，從而達到精確給藥的目的。在體外細胞試驗，我們發現BDM3及殼聚糖包封BDM3的免疫納米顆粒有抑制肝癌細胞增殖的作用[7]。BDM3及BDM3免疫納米顆粒有望成為肝癌導向治療較理想的載體。99mTc具有半衰期短、能量低等良好的物理特性。本研究將進行99mTc標記抗體，觀察其在荷肝癌動物體內的靶向分布，及其對腫瘤的抑制作用，以探討放射免疫顯像診斷肝癌和靶向治療的價值。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器 取4～6周齡雌性BALB/c-nu裸鼠30只，由中山大學醫學院動物實驗中心提供；肝癌細胞株 （Bel-7402、HepG2、SMMC-7721）為本實驗室貯藏；抗肝癌雙鏈抗體及抗體納米顆粒均為本實驗室制備，等電點為5.9；殼聚糖（脫已酰度>85%，黏度=2500 cps）為濟南海得貝生物技術有限公司產品；殼聚糖使用前用Co60γ-輻射（25 kGy劑量）滅菌；DMEM（Dulbecco's modified Eagle medium）細胞培養基干粉為美國Gibco公司產品，亞甲基二磷酸鹽（MDP）、二氯化錫（SnCl2-H2O）及新鮮淋洗液99mTc為本院核醫學科提供；使用美國CAPINTEC公司GE Infinia-Hawkeye同位素分析儀。

1.2 抗肝癌雙鏈抗體及抗體納米顆粒的制備 按文獻

[8～10]方法進行BDM3及BDM3納米顆粒制備。納米粒子具體制備方法如下：離子交聯法制備殼聚糖/抗體二聚體BDM3納米粒子，稱取殼聚糖6 mg，攪拌溶解于1%冰醋酸溶液6 ml中，配制得到殼聚糖溶液，將抗肝癌單鏈抗體二聚體BDM3分別配制成濃度為0.1、0.5、1 g/L的水溶液；分別取去離子水和不同濃度抗體二聚體溶液1 ml，加入殼聚糖溶液，調節溶液的pH，用電磁攪拌器中速攪拌5 min；磁力攪拌下緩慢滴加1 ml TPP（0.1%）水溶液，繼續攪拌30 min，得到乳光液；4℃條件下，20000 r/m的轉速高速離心30 min；沉淀物用蒸餾水反復洗滌，冷凍干燥，得到的白色粉末即為殼聚糖納米粒子和殼聚糖/抗體二聚體BDM3納米粒子。

1.3 納米顆粒濃度、包封率及載藥量的測定 將負載了不同濃度的抗肝癌單鏈抗體二聚體BDM的納米粒子懸浮液用20000 r/m超速離心30 min，用BCA試劑盒測定上清液中游離的抗肝癌單鏈抗體二聚體BDM的量，納米粒子對抗肝癌單鏈抗體二聚體BDM的包封率和載藥量用以下公式計算：BDM的包封率=（投入BDM總量-游離BDM量）/投入BDM總量×100%；BDM的載藥量 =已包裹BDM總量/微球總量×100%

1.4 抗肝癌抗體及抗體納米顆粒的99mTc標記 采用99mTc預亞錫標記法[11]標記，即取亞甲基二膦酸鈉凍干品 1支，內含亞甲基二膦酸鈉 5 mg，二氯化錫 0.5 mg。加2 ml生理鹽水溶解。分別取 5 mg抗BDM3抗體及BDM3納米顆粒，加入上述亞甲基二膦酸鈉稀釋液40μl，99mTc新鮮淋洗液37MBq 0.2 ml，充分混合后，在室溫下放置5 min。采用同位素分析儀檢測BDM3及其納米顆粒的99mTc標記率。

1.5 荷人肝癌裸鼠模型的建立 將30只 BALB/c-nu裸鼠隨機分為3組。分別將Bel-7402、HepG2和SMMC-7721細胞消化，按1∶1∶1混勻，用DMEM細胞培養液稀釋成1×107/ml，取0.1 ml接種于裸鼠左上肢腋窩皮下，2 w后腫瘤長至0.5～1 cm3時開始實驗。

1.699mTc標記抗體及抗體納米顆粒在荷人肝癌裸鼠體內的分布 將荷人肝癌裸鼠30只隨機分為A、B、C三組，每組10只。A組通過腹腔注射99mTc-生理鹽水，B組注射99mTc-BDM3，C組注射99mTc-BDM3納米顆粒。在注入上述99mTc標記物后分別于1 h、4 h和8 h將裸鼠固定后置于SPECT儀下，窗寬20%，VPC6準直器，矩陣128×128，采集計數為1×105。完成圖像采集后，分別處死各組裸鼠，取腫瘤、全血及肝臟、心臟、腎臟及腦，予濾紙吸干血液，分別稱質量，測放射性計數，計算瘤（T）/非瘤（NT）比值。

1.7 統計學處理 所有數據用SPSS15.0 for Windows軟件包進行處理，實驗數據用（±s）表示，采用t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 抗肝癌雙鏈抗體及抗體納米顆粒的制備情況 抗肝癌雙鏈抗體BDM3的等電點為5.9，濃度為1 g/L，BDM3納米顆粒的抗體包封率為53%，每毫克殼聚糖納米粒子含BDM3為75μg。

2.299mTc的測定情況 使用同位素分析儀檢測生理鹽水的99mTc標記率為90%，抗肝癌雙鏈抗體BDM3的99mTc標記率為91%，BDM3納米顆粒的99mTc標記率為92%。

2.3 放射性顯像情況99mTc標記的抗肝癌雙鏈抗體BDM3及抗體納米顆粒在荷人肝癌裸鼠體內的生物學分布見表1～表3。B組在注射99mTc-BDM3后1～8 h，裸鼠腫瘤組織中均可出現放射性濃聚，其中在4 h時放射性濃集明顯高于其他器官組織；C組在注射99mTc-BDM3納米顆粒后1～8 h，裸鼠腫瘤組織中均出現較高的放射性濃聚，在4 h時放射性濃集明顯高于其他器官組織；而A組在注射99mTc生理鹽水后1～8 h，任何器官均無特異性放射性濃聚。C組腫瘤 /血比值在4 h最高，達到（5.63±0.26），與其他時間比較差異有統計學意義。B組和C組 20只裸鼠瘤區明確顯像，顯像率為100%，A組與B組T/NT比值比較差異有統計學意義（P＜0.01），A組與C組T/NT比值比較差異有統計學意義（P＜0.001），B組與C組T/NT比值比較差異有統計學意義（P＜0.05）。4 h腫瘤顯像見圖1a和圖1b，血液本底及其他臟器檢查核素分布顯著降低，與體內生物學分布測定結果一致。A組在4 h時腫瘤組織始終沒有特異性核素濃聚（圖1c）。

表1 荷肝癌裸鼠腹腔注入99mTc-BDM3后各臟器T/NT值（±s）變化

表1 荷肝癌裸鼠腹腔注入99mTc-BDM3后各臟器T/NT值（±s）變化

臟器 1h 4h 8h血1.63±0.173.82±0.240.48±0.21心1.42±0.153.70±0.311.02±0.17肝1.55±0.114.03±0.591.50±0.20腎1.12±0.032.43±0.121.09±0.04肺1.37±0.342.82±0.410.97±0.19

表2 荷肝癌裸鼠腹腔注入99mTc-BDM3納米顆粒后各臟器T/NT值（±s）變化

表2 荷肝癌裸鼠腹腔注入99mTc-BDM3納米顆粒后各臟器T/NT值（±s）變化

臟器 1h 4h 8h血3.63±0.215.63±0.261.41±0.32心3.12±0.154.70±0.311.02±0.17肝3.55±0.114.03±0.591.50±0.20腎3.12±0.035.43±0.121.09±0.04肺3.37±0.345.82±0.410.97±0.19

表3 荷肝癌裸鼠腹腔注入99mTc–生理鹽水后各臟器T/NT值（±s）變化

表3 荷肝癌裸鼠腹腔注入99mTc–生理鹽水后各臟器T/NT值（±s）變化

臟器 1h 4h 8h血0.61±0.211.03±0.260.41±0.32心0.12±0.150.70±0.310.32±0.01肝0.51±0.121.13±0.190.50±0.10腎0.13±0.051.12±0.110.29±0.03肺0.37±0.040.82±0.310.27±0.19

圖1 三組動物在腹腔注射99mTc后4 h顯像情況

3 討論

近年來，抗腫瘤抗體靶向治療受到密切關注，用單克隆抗體及單鏈抗體進行放射免疫顯像對腫瘤進行早期診斷及治療在國內外已經有很多報道[12～15]。但由于完整的抗體分子量大，不容易穿透組織到達腫瘤部位，或在腫瘤組織中清除緩慢，不易到達靶組織，特別是由于單克隆抗體為鼠源性抗體，可誘發人抗鼠抗體（human anti-mouse antibody，HAMA）反應，而由于單鏈抗體分子量太小，只有完整抗體的1/6，存在親和力弱、穩定性差和體內清除過快等不足，使其在人體內的應用受到不同程度的限制。

本實驗室所制備的雙鏈抗體為二價抗體，克服了單克隆及單鏈抗體的不足，具有親和力好、免疫原性低、穩定性好、活性高等優點，適合腫瘤的放免顯像和靶向治療[3]。而納米載藥系統具有超微小體積，可通過人體最小的毛細血管，不易被吞噬細胞迅速清除，延長了在循環系統中的存留時間和藥物的半衰期，可維持有效的血藥濃度，減少給藥次數，提高療效；能夠穿透組織間隙并被細胞吸收，改變生物膜運轉機制，增加藥物對膜的透過性，有利于吸收和細胞內藥效的發揮；由于載藥納米粒子的粘附性以及小的粒徑，既有利于局部用藥時滯留性的增加，也有利于提高藥物與腸壁的接觸時間和接觸面積，提高生物利用度[16～18]，目前也被廣泛用于靶向治療。本研究的主要目的在于分析抗肝癌雙鏈抗體BDM3及其納米顆粒在荷肝癌裸鼠體內的靶腫瘤分布特性，從而為肝癌早期診斷及治療提供一個新的途徑。

本研究經腹腔分別注射99mTc-生理鹽水、99mT c-BDM3和99mT c-BDM3納米顆粒至荷肝癌裸鼠，觀察 1 h、4 h和8 h腫瘤顯像。在注射99mTc-BDM3和99mTc-BDM3納米顆粒后1～8 h，裸鼠腫瘤組織中均可出現放射性濃聚，其中在4 h時裸鼠腫瘤組織中的放射性分布明顯高于其他器官組織，而對照組在注射99mTc-生理鹽水后1～8 h均無特異性放射性濃聚。注射99mTc-BDM3和99mT c-BDM3納米顆粒裸鼠的顯像率為100%。

本研究結果顯示，同位素標記的雙鏈抗體及雙鏈抗體納米顆粒均能很好地在腫瘤組織中濃聚，而在非腫瘤組織中無濃聚現象，原因考慮為該抗體為抗肝癌特異性抗體，具有明確靶向性，而抗體納米顆粒注射組濃聚現象較抗體組更顯著，考慮為抗體納米顆粒具有雙重靶向作用，能更好地聚集在腫瘤組織，增加顯像效果。該結果符合我們目前腫瘤治療的策略，既可最大限度地發揮抗腫瘤作用，同時又最大限度地減少對正常細胞的毒副作用。故本實驗室制備的抗肝癌雙鏈抗體及其納米顆粒對肝癌組織具有很好的親和力，可望作為肝癌診斷和治療的靶向載體。

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