溫石棉及其代用纖維對(duì)鼠細(xì)胞鈣激活蛋白43及B淋巴細(xì)胞瘤-2表達(dá)的影響

王洪州，鄧麗娟，王利民，董發(fā)勤

(1.四川綿陽(yáng)四0四醫(yī)院，川北醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 綿陽(yáng) 621000;2.西南科技大學(xué)校長(zhǎng)辦公室，四川 綿陽(yáng) 621000)

國(guó)際上對(duì)溫石棉的生物安全性存在較大爭(zhēng)議［1，2］，一些學(xué)者認(rèn)為溫石棉的毒性和溫石棉的所帶金屬離子、表面電荷、產(chǎn)地等性質(zhì)有較大關(guān)系;另一些學(xué)者認(rèn)為溫石棉的代用纖維也能夠引起慢性肺炎，并且發(fā)現(xiàn)巖棉纖維可引起基因突變。也有學(xué)者認(rèn)為溫石棉與煙溶液聯(lián)合對(duì)人胚肺細(xì)胞DNA的損傷具有協(xié)同作用［3～6］。由此可見(jiàn)溫石棉的代用纖維對(duì)人體可能也不安全。2008年7月至2013年7月本研究利用免疫組化方法檢測(cè)腫瘤基因表達(dá)，一方面擬證實(shí)其毒性，另一方面探討其致癌的部分機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①細(xì)胞來(lái)源:中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞(Chinese Hamster Lung Cell，V79細(xì)胞)購(gòu)買自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。②溫石棉:四川新康溫石棉，陜西陜南溫石棉、玻璃纖維，陶瓷纖維，硅灰石，巖棉來(lái)自四川西南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。③兔抗鼠EGFR、Survivin單克隆抗體購(gòu)于武漢博士德公司。④免疫組化SABC試劑盒(SA1022)購(gòu)于武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 制備實(shí)驗(yàn)組粉體及其懸液 先將各實(shí)驗(yàn)原礦處理成長(zhǎng)度5 μm左右，具體方法:將實(shí)驗(yàn)原礦反復(fù)碾壓、劈分、剪短后，然后再進(jìn)行細(xì)研磨，之后進(jìn)行篩選過(guò)濾;然后烘干，最后研磨成更細(xì)的粉體。其電鏡圖片如圖1。用高溫殺菌消毒各種實(shí)驗(yàn)粉體，配置成6 個(gè)不同濃度(1、2、4、6、8、10 mg/L)。

圖1 溫石棉及其代用品粉體的掃描電鏡圖 a:四川新康溫石棉;b:陜西陜南溫石棉;c:玻璃纖維;d:陶瓷纖維;e:巖棉;f:硅灰石

1.2.2 免疫組組織化學(xué)檢測(cè)腫瘤基因鈣激活蛋它43(calciumactinated protein 43，CAP43)及 B 淋巴細(xì)胞癌-2(B-cell lymghoma，Bcl-2)的表達(dá)

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)共分為7組，四川新康溫石棉組(A組)、陜西陜南溫石棉組(B組)、玻璃纖維組(C組)、陶瓷纖維組(D組)、硅灰石組(E組)、巖棉組(F組)和陰性對(duì)照組(G組)。

1.2.2.2 干預(yù)措施 將各實(shí)驗(yàn)組6種粉體的6個(gè)不同濃度(1、2、4、6、8、10 mg/L)的粉體懸液分別取1 ml滴到各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中。將染毒的細(xì)胞放到CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。G組為陰性對(duì)照組，不加入上述任何粉體懸液，其他步驟同上。

1.2.2.3 檢測(cè)方法 預(yù)先將處理后的蓋玻片放入6孔板里，將細(xì)胞接種到蓋玻片上，細(xì)胞量為2×105/孔。將調(diào)整好的細(xì)胞懸液1 ml，分別加入到培養(yǎng)板各孔中。然后把接種到培養(yǎng)板的細(xì)胞放入到CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將小鼠分為6組，每組3只，將六種粉體懸液的6個(gè)不同濃度的粉體懸液分別取1 ml滴到各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中。將染毒的細(xì)胞放到CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。第7組為空白對(duì)照組，不加入上述任何粉體懸液，其他步驟同上。CAP43以及Bcl-2的免疫組織化學(xué)染色根據(jù)SABC法進(jìn)行，主要步驟:①將染毒的細(xì)胞放到CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，吸盡6孔板培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，滴入丙酮處理30 min，吸盡每孔中的丙酮，蒸餾水沖洗3次;②30%的H2O21份+純甲醇50份混合，室溫浸泡30 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。蒸餾水沖洗3次;③滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗;④每孔滴入一抗，Survivin以及EGFR稀釋度為1∶200。37℃下孵育60 min，然后置4℃冰箱過(guò)夜;⑤室溫下復(fù)溫20 min，PBS(pH 7.2～7.6)沖洗5 min×3次;⑥滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃ 20 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗2 min×3次;⑦滴加試劑SABC，37℃ 20 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min×4次;⑧新鮮配制的DAB溶液顯色5 min;⑨自來(lái)水沖洗后蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水封片。

1.2.2.4 免疫組化染色結(jié)果判斷及分析 陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞漿、細(xì)胞膜或胞核呈棕黃色。倒置顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野(10×40)，用Image-ProPlus專業(yè)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)其平均光密度(OD)值，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析及SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的免疫組化染色結(jié)果見(jiàn)圖2～圖5，OD值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1～表2。CAP43、Bcl-2在陰性對(duì)照組未見(jiàn)表達(dá)(見(jiàn)圖4、圖5)，在 A、B、C、D、E、F各組內(nèi)不同濃度間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Survivin的陽(yáng)性表達(dá)主要在細(xì)胞漿，細(xì)胞膜和細(xì)胞核有少量表達(dá);EGFR的表達(dá)主要分布于V79細(xì)胞的細(xì)胞漿，在細(xì)胞核亦有少量表達(dá)。不同濃度溫石棉及其代用品粉體懸液染毒V79細(xì)胞后，A、B組與其它組比較，EGFR、Survivin的表達(dá)最強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);A組和B組比較，EGFR、Survivin的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);各組隨粉體濃度增加，EGFR、Survivin的表達(dá)均逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，呈現(xiàn)濃度依賴性。

圖2 粉體作用72 h后CAP43基因在B組V79中的表達(dá)(10×20)

圖3 粉體作用72 h后BCL-2基因在A組V79中的表達(dá)(10×20)

圖4 陰性對(duì)照組免疫組化染色CAP43基因呈陰性表達(dá)(10×20)

圖5 陰性對(duì)照組免疫組化染色BCL-2基因基因呈陰性表達(dá)(10×40)

表1 CAP43基因在V79細(xì)胞中的表達(dá) (OD值)

表2 Bcl-2基因在V79細(xì)胞中的表達(dá) (OD值)

3 討論

Bcl-2是近年較受關(guān)注的一個(gè)凋亡抑制基因，Bcl-2的表達(dá)提示細(xì)胞凋亡受到抑制［7］，該基因定位于人染色體18q21上，蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞漿及細(xì)胞膜。研究認(rèn)為，Bcl-2在多種惡性腫瘤(膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、腎癌等)中存在特異性表達(dá)，且其表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)［8］。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出不同濃度溫石棉及其代用品處理倉(cāng)鼠肺細(xì)胞72小時(shí)后，出現(xiàn)Bcl-2基因表達(dá)的顯著上調(diào)，并以陜西陜南溫石棉組及四川新康溫石棉組為最明顯，提示溫石棉及其代用品致癌的可能機(jī)制與Bcl-2基因高表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞惡變相關(guān)。

CAP43基因定位于人類染色體8q24，又名N-myc下游調(diào)節(jié)基因(NDRG1)，在正常組織中表達(dá)很低，但廣泛表達(dá)于人類多種腫瘤組織如在肺癌、腦腫瘤、黑色素瘤、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌中，CAP43蛋白過(guò)量表達(dá)［9，10］。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出不同濃度溫石棉及代用品粉體處理倉(cāng)鼠肺細(xì)胞72小時(shí)后，出現(xiàn)CAP43基因表達(dá)的顯著上調(diào)，并以陜西陜南溫石棉組及四川新康溫石棉組為最明顯，提示溫石棉及其代用品粉體致癌的可能機(jī)制與CAP43在細(xì)胞組織中表達(dá)顯著升高相關(guān)。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出不同濃度溫石棉及代用品粉體處理V79細(xì)胞72小時(shí)后可使細(xì)胞受損，從而誘導(dǎo)上皮細(xì)胞CAP43和Bcl-2基因表達(dá)的上調(diào)，隨著暴露濃度的增加，CAP43和Bcl-2的表達(dá)呈進(jìn)一步上調(diào)趨勢(shì)。由此可見(jiàn)溫石棉及其代用品具有潛在致癌性，其部分機(jī)制可能為上調(diào)腫瘤基因CAP43和Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞癌變。但是，從實(shí)驗(yàn)本身來(lái)說(shuō)，還存在如下問(wèn)題，溫石棉以及其代用品是如何影響CAP43和Bcl-2的表達(dá)，通過(guò)什么物質(zhì)進(jìn)行影響，影響通道是什么還需要進(jìn)一步考察。筆者認(rèn)為，在后期的試驗(yàn)中，應(yīng)當(dāng)適當(dāng)增加A組以及B組的樣本量，仔細(xì)考察溫石棉以及其代用品對(duì)于CAP43和Bcl-2的作用途徑。但總的來(lái)說(shuō)，本文為后期實(shí)驗(yàn)起到了鋪墊作用，通過(guò)本文實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，溫石棉及其代用纖維對(duì)于鼠細(xì)胞CAP43和Bcl-2表達(dá)有顯著的增強(qiáng)作用。

［1］ Yarborough CM.Chrysotile as a cause of mesothelioma:an assessment based on epidemiology ［J］.Crit Rev Toxicol，2006，36(2):165-187.

［2］ Bernstein DM，Hoskins JA.The health effects of chrysotile:current perspective based upon recent data［J］.Regul Toxicol Pharmacol，2006，45(3):252-264.

［3］ Gazzano E，Turci F，F(xiàn)oresti E，et al.Iron-loaded synthetic chrysotile:a new model solid for studying the role of iron in asbestos toxicity［J］.Chem Res Toxicol，2007，20(3):380-387.

［4］ Poser I，Rahman Q，Lohani M，et al.Modulation of genotoxic effects in asbestos-exposed primary human mesothelial cells by radical scavengers，metal chelators and a glutathione precursor［J］.Mutat Res，2004，559(1-2):19-27.

［5］ Shibata K，Kudo Y，Tsunoda M，et al.Magnetometric evaluation of the effects of man-made mineral fibers on the function of macrophages using the macrophage cell line RAW 264.7［J］.IND Health，2007，45(3):426-436.

［6］ 王起恩，韓春華.溫石棉與煙溶液作用后人肺泡上皮細(xì)胞DNA的損傷及修復(fù)［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2000，34(1):25-27.

［7］ Yu J，Zhou XM，He XS，et al.Curcumin induces apoptosis involving bax/bcl-2 in human hepatoma SMMC-7721 cells［J］.Asian Pacific J Cancer Prev，2011，12(8):1925-1929.

［8］ 姚維深，周國(guó)華，張旭.Bcl-2和Beclinl及PTEN在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2013，34(10):1538-1540.

［9］ 王水紅，馬應(yīng)杰.大腸癌組織中Cap43蛋白的表達(dá)變化及意義［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(6):55-56.

［10］ Cangul H，Salnikow K，Yee H，et al.Enhanced overexpression of an HIF-1/hypoxia-related protein in cancer cells［J］.Environ Health Perspect，2002，110(5):108-110.