氯化汞對鯉幼魚鰓組織抗氧化系統和組織損傷研究

姜會民

山東高校十二五規劃重點實驗室“動物生理與生化及應用”重點實驗室，菏澤 274015

氯化汞對鯉幼魚鰓組織抗氧化系統和組織損傷研究

姜會民*

山東高校十二五規劃重點實驗室“動物生理與生化及應用”重點實驗室，菏澤 274015

在急性毒性試驗的基礎上，設定0.052 mg·L-1(SL)、0.13 mg·L-1(SM)、0.26 mg·L-1(SH)三個汞離子染毒濃度和一個對照組(SC)研究無機汞污染對黃河鯉幼魚鰓組織過氧化物酶(POD)活性和(丙二醛)MDA含量以及鰓組織損傷的影響。實驗結果顯示：POD活性隨氯化汞濃度的增加先上升后下降，當濃度為0.26 mg·L-1時POD活性顯著的低于對照組(p < 0.05)；實驗組MDA含量均顯著高于對照組(p < 0.05)；實驗組鰓組織可見鰓小片腫脹，基部增生，上皮細胞脫落，泌氯細胞增多，細胞核溶解及金屬沉積。試驗結果表明氯化汞對鯉鰓組織結構和抗氧化系統具有明顯的損傷。

氯化汞；鰓；過氧化物酶；丙二醛；組織損傷

汞( mercury Hg)是一種廣泛分布于環境中的劇毒金屬， 隨著含汞農藥在農業生產過程的使用，以及冶金、印染、木材防腐等含汞廢水在工業生產中大量排放,造成了水環境中汞污染問題日益嚴峻[1]。特別是日本水俁病出現后，汞污染成為重金屬污染物中的研究重點[2]。已有的研究結果表明[3]，水體中Hg2+的毒性及危害作用表現在水體中的Hg2+通過魚類等水生生物富集并在體內積累，進而隨食物鏈傳遞的生物放大作用，最后在人體內積累，對人體產生毒性作用。其毒性機理表現為：Hg2+與體內許多重要酶的活性中心巰基結合而抑制一系列含巰基的酶的生理功能，從而影響細胞的正常代謝功能[4]。Canli 研究發現[5]，鰓是挪威龍蝦從水體吸收并蓄積汞的主要器官；我們課題組實驗結果證明[6]，水體高濃度的Hg2+能夠對蟹鰓的組織結構造成明顯的破壞；藺玉華報道[7]，甲基汞200 μg·L-1染毒24 h和80 μg·L-1染毒1周后鯉魚鰓絲嚴重卷曲，氯細胞損傷明顯。鯉魚(Cyprinus carpio)是原產于亞洲的溫帶性淡水魚，養殖廣泛，便于實驗室內飼養管理。張毓琪研究得出[8]，無機汞可影響鯉魚體組織中元素含量的變化，彭德姣研究結論[9]，無機汞主要富集于鯉魚內臟，其次是肌肉。目前尚無無機汞對鯉鰓組織抗氧化功能和組織損傷的報道。本研究在急性毒性試驗的基礎上進行慢性染毒的試驗，研究不同濃度下的汞對鯉鰓組織結構損傷和抗氧化系統的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗動物

黃河鯉幼魚(以下簡稱鯉魚) (80.70±10.90) g，體長(15.5±2.5) cm，由菏澤辛集魚苗養殖場提供。

1.2 主要藥品與儀器

藥品：分析純氯化汞(HgCl2·2H2O)；蘇木精；伊紅；MDA，POD檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

儀器設備：電腦生物組織包埋機(KD-BM)；包埋機冷凍臺(KD-BL)；自動脫水機(KD-TS3A)組織切片機；顯微鏡(Olympus)；成像系統(DP72)；染色缸；自動組織染色機(AO-820)；電熱鼓風干燥箱(CS101-2AB)；電熱恒溫槽(S.H.W21-CR420)；臺式高速冰凍離心機(Eppendof)；TU-1810紫外可見分光光度計(北京普西)；玻璃勻漿器；電熱恒溫水浴鍋；滅菌器。

1.3 試驗設計

將鯉魚在實驗室玻璃水族箱(200 cm×60 cm×100 cm)馴養10 d后進行染毒試驗，試驗前先配置母液，后稀釋至試驗所需要的各級濃度。急性毒性試驗的容器為PVC材料，實驗根據前期預實驗結果確定氯化汞質量濃度范圍( 96 h后全致死濃度和全存活濃度)，設置汞間隔濃度共5個濃度組和一個對照組，每個濃度組設2個平行，每一實驗容器內各放入15條魚開展急性毒性實驗。試驗室溫為20 ℃，溶解氧為6～8 ppm，pH值6.5～8.5。分別用對應濃度的溶液浸洗實驗容器，觀測受試鯉魚的活動情況，及時取出死亡個體，每24小時重新配置溶液。LC50的獲取采用修瑞琴等[10]的方法求得為0.52 mg·L-1。

本試驗在急性毒性試驗的結果基礎上設定四個水平。對照組(SC)試驗水體中不添加氯化汞；低濃度試驗組(SL)氯化汞濃度為0.052 mg·L-1( LC50/10)；中濃度試驗組(SM)氯化汞的濃度為的 0.13 mg·L-1( LC50/4)；高濃度試驗組(SH)氯化汞的濃度為0.26 mg·L-1(LC50/2)。染毒期為30 d，染毒期間室內溫度、水體溶解氧、pH值同上。

1.4 MDA含量和POD活性測定

試驗的1 d、3 d、7 d各組隨機選取三條魚在冰盤上解剖，取鯉魚左側腮，稱取組織重量，并按重量(g)/體積(v)=1：9的比例加入生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液進行過氧化物酶(POD)酶活力、丙二醛(MDA)含量和蛋白質含量測定。操作方法和單位的定義見南京建成生物工程研究所試劑盒操作說明。

1.5 組織學切片

取右側鰓，Bouin氏固定液固定、常規梯度酒精脫水、石蠟包埋，切片厚 6 μm，H.E 染色。

1.6 數據的整理與統計分析

用SPSS軟件對各處理組酶活性和MDA含量進行(One-way ANOVA)方差分析，顯著性檢驗采用最小顯著差數法(LSD)。

2 結果(Results)

2.1 氯化汞對于鯉魚的急性毒性觀察

在急性毒性試驗期間，觀察鯉魚中毒癥狀初期表現為“毒物興奮效應”。可見鯉魚對于外界刺激反映異常活躍，無刺激情況下表現為上下或者旋轉方向快速運動，有時表現為側向游動，應為神經系統受損。染毒2 h 后發現高濃度組魚體表面皮膚上覆蓋有一層白色黏液，隨之在6 h后中濃度魚體表也出現類似的反應。取出死亡魚體解剖發現除了體表的大量白色黏液外，鰓蓋外側和眼球周圍也存在大量的白色黏液。同時部分鯉魚出現了鱗片脫落，軀干或者尾部彎曲等中毒癥狀。

2.2 氯化汞對于鯉魚鰓組織抗氧化酶活性影響

如圖1所示，隨Hg2+濃度的增加，鰓POD活性出現先上升后下降的規律性變化，SL組染毒3 d時鰓POD活性為最大值389.55 U·mg-1prot，極顯著高于對照組(p<0.01)，隨Hg2+濃度的繼續增加鰓POD活性下降。1 d時SH組POD活性顯著低于SC(p<0.05)，SL組POD活性極顯著高于SC(p<0.01)； 3d時SL組POD活性極顯著的高于SC(p<0.01)，SM組 POD活性顯著的高于SC(p<0.05)；7 d時SM組POD活性顯著的高于SC(p<0.05)。

如圖2所示，隨Hg2+濃度的增加鰓組織MDA含量出現先上升后下降的規律性變化，SM組染毒3 d時鰓MDA含量為最大值33.80 nmol·mg-1prot，隨Hg2+濃度的增加時間延長鰓MDA含量下降。1 d時各組MDA含量顯著高于對照組(p<0.05)；3 d時SM、SH組極顯著高于SC組(p<0.01)，SL組顯著高于SC組(p<0.05)；7 d時SM組極顯著高于SC組(p<0.01)，SL組、SH組顯著高于SC組(p<0.05)。

圖1 氯化汞對鯉鰓組織POD活性的影響注：圖中*表示與對照組相比差異顯著；**表示與對照組相比差異極顯著，以下同。Fig. 1 The effect of mercury chloride on the activity of POD in the gill tissues of carpsNote: “*” indicates significant difference compared with the control group; “* *” indicates very significant difference compared with the control group. the same as follows.

圖2 氯化汞對鯉鰓組織MDA含量的影響Fig. 2 The effect of mercury chloride on the contents of MDA in the gill tissues of carps

2.3 氯化汞對于鯉魚鰓組織損傷觀察

暴露于低濃度Hg2+溶液中的鯉魚鰓小片與對照組(圖3A)相比出現腫脹增生(圖3B)；在中濃度組、高濃度組鯉鰓小片腫脹更加明顯，相鄰鰓小片黏連(圖3C)。

與對照組和低濃度組(圖4A)相比，中濃度及高濃度組鰓小片可見增生細胞，上皮細胞脫落(圖4B)；鰓小片基部泌氯細胞增多，支持細胞界限模糊，細胞核結構溶解(圖4C)；鰓小片金屬沉積，空泡細胞數目增多(圖4D)。

圖3 染毒氯化汞對鯉鰓小片組織損傷整體結構的觀察A SC鰓小片(H.E，×400)；B SL鰓小片：BP表示基部增生(H.E，×400)；C SM，SH鰓小片：LS表示鰓小片腫脹(H.E，×400)Fig. 3 Effect of mercury chloride on the overall structure of gill lamellae on carpA Gill lamellae of control(H. E, ×400)；B Gill lamellae of Low concentrations(H. E, ×400)；C Gill lamellae of Middle concentrations, High concentrations

對照組入鰓動脈血管血細胞染色均勻無金屬色素沉積(圖5A)，在汞金屬染毒各組可見入鰓動脈血管和管壁中金屬沉積(圖5B)，中、高濃度組鯉鰓絲血管中也可見到金屬的沉積(圖5C(縱切)、5D(橫切))，同時在高濃度組鰓小片基部毛細血管中也見到金屬沉積(圖5E)。

3 討論(Discussion)

生物在受脅迫時會產生大量氧自由基，對機體產生毒害[11]。POD 催化過氧化氫與氫供給體之間的氧化反應[12]，從而分解體內產生的部分有毒物質H2O2，使機體維持較低而有效的自由基水平[13]。研究表明，生物在輕度逆境脅迫時，POD 會升高來抵御外界刺激，在重度逆境脅迫下超過機體抵御能力，POD會降低[14]。本試驗結果顯示隨Hg2+濃度的增加，鰓POD活性出現先上升后下降的規律性變化，表明了在低濃度條件下Hg2+刺激了魚體內抗氧化系統，使鰓組織POD酶活性升高，而隨Hg2+濃度的繼續增大鰓組織POD活性下降，與焦傳珍結果一致[14]。隨染毒時間的延長低濃度組POD活性先升高后降低，在低濃度組3d時POD酶活性達最高值，說明時間對Hg2+在鯉機體內生理代謝有影響，Hg2+的毒性有時間累積效應，隨時間的延長機體產生的過量自由基或過氧化產物致抗氧化酶變性從而降低了其活性，或者這些物質阻礙了酶的轉錄或者翻譯的過程，或是機體中無機汞發生甲基化，使得其毒性進一步增強。

圖5 染毒氯化汞對鯉鰓部血管汞沉積的觀察A SC入鰓動脈(H.E，×1000)； B SL、SM、SH入鰓動脈，圖中MD表示金屬沉積(H.E，×1000)；C SH, SM鰓絲動脈，圖中MD表示金屬沉積(H.E，×1000縱切)；D SH, SW鰓絲動脈，圖中MD表示金屬沉積(H.E，×1000橫切)；E SH鰓小片基部毛細血管，圖中MD表示金屬沉積(H.E，×1000)Fig. 5 The observation of mercury deposition in carp gill vessels exposed to mercuryA The artery of branchial on SC(H.E, ×1000)；B The artery of branchial on SL, SH, SM(H.E, ×1000)；C The arteries of gill filaments on SH, SM(Slitting)(H.E, ×1000)；D The arteries of gill filaments on SH, SM (Crosscutting)(H.E, ×1000)；E The capillaries of the base of Gill lamellae (H.E, ×1000)

生物膜中磷脂有多個不飽和鍵，因此生物膜易受自由基攻擊，多不飽和脂肪酸中LH會在R的作用下啟動LPO鏈式反應[15]。在脂質過氧化產物中，丙二醛(MDA)被認為是脂質過氧化水平的間接反映，因此，MDA的檢測在水生態毒理學機制研究中越來越受到重視[16]。本試驗隨Hg2+濃度的增加，鰓組織MDA含量出現先上升后下降的規律性變化，當Hg2+濃度為0.13 mg·Kg-1染毒3 d時鰓MDA含量為最大值33.80 nmol·mg-1prot，隨Hg2+濃度的增加和時間延長鰓MDA含量下降，提示水體Hg2+可直接影響鯉魚體內的脂質過氧化水平從而造成機體細胞膜的氧化性損傷，表現為低濃度促進高濃度抑制。這可能是低濃度的Hg2+誘導機體POD等抗氧化酶的活性，同時與體內的大量的自由基反應，因此MDA含量增加，而高濃度的Hg2+抑制了機體內抗氧化酶活性，所以脂質過氧化反應產物MDA含量下降。中濃度染毒組鰓MDA含量最高，而此時POD活性顯著下降到對照水平，可能是MDA可進一步與蛋白質形成交聯物，使酶的結構和功能遭到破壞，進而降低抗氧化酶的活力[17]。因此機體內抗氧化酶的活性和其代謝物的含量相互影響。試驗結果顯示，染毒時間同樣影響鰓組織MDA含量，3 d時各Hg2+染毒濃度組MDA含量最高，可能是魚在初期隨染毒時間延長體內汞含量不斷增加，因為魚類對水中汞的蓄積是沒有低限的[18]，后期隨時間的繼續延長蓄積的汞濃度導致其抗氧化酶的活性受到一定水平的抑制所以鰓組織MDA含量下降。

鰓為許多毒物作用的靶器官[19]，關海紅研究發現，重金屬對松浦鯉鰓組織的損傷程度最大[20]。本研究表明，在低濃度Hg2+暴露下鰓小片出現增生，入鰓動脈出現色素沉積，說明鯉鰓組織是Hg2+毒性作用的靶器官之一。Vensna將魚類鰓組織細胞受到毒物脅迫造成的損傷分為兩類： 一是因防御而產生的損傷，包括上皮細胞肥大和增生，鰓小片呼吸上皮水腫等； 二是直接造成的損傷，包括鰓絲上皮脫落與壞死等[21]。本試驗觀察中濃度、高濃度組鰓小片間細胞增生，上皮細胞脫落，鰓小片基部泌氯細胞增多，支持細胞間界限模糊，細胞核結構溶解，空泡細胞數目增多，揭示Hg2+暴露不但引起了機體鰓組織的防御反應而且直接損傷了鰓組織細胞。低濃度Hg2+染毒鰓組織中僅在入鰓大動脈中見金屬沉積，中濃度鰓組織中鰓絲動脈中可見金屬沉積，高濃度中不僅在大動脈中可見汞金屬沉積在鰓小片基部毛細血管中也有金屬沉積。血管中沉積的金屬可能為Hg2+結合了蛋白顯示的金屬顏色，鰓血管中的金屬沉積顆粒較大可能阻塞毛細血管，從而引起鰓組織損傷。

致謝：論文實驗、撰寫和修改過程得到了菏澤學院楚德昌、朱道玉教授，張紅梅副教授大量幫助，圖表的制作得到了計算機系劉學老師的指導，謹此表示感謝。

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EffectofMercuryChlorideonAntioxidantSystemandInjuryinGillofCarps

Jiang Huimin

The Key Laboratory of Shandong University “the Application of Animal Physiology and Biochemistry” Heze 274015, China

26 May 2014accepted9 July 2014

Based on the acute toxicity test, three mercury exposure concentration groups (0.052 mg·L-1、0.13 mg·L-1、0.26 mg·L-1)and one control group were set to study the effect of mercury on activity of peroxidase(POD) and content of malondialdehyde (MDA) on gills as well as the injury of gill tissue. Results showed as follows: The activity of POD increased and then decreased with the concentration of mercury chloride increased, the activity of POD in SH group was significantly lower than that of the control group (p<0.05); The content of MDA in experiment group was significantly higher than that of control group (p<0.05 ); The gill lamella of carps swelled, the base of gill lamella appeared hyperplasia, epithelial cells shed, the number of vacuolated cells increased, the cells of chloride increased, and the nucleus was dissolved, the deposition of mercury was visible. The results showed that mercury chloride has a significant effect on activities of antioxidant system and tissue injury in gill of carp.

mercury chloride; gills; POD; MDA; injury

山東高校十二五規劃重點實驗室"動物生理與生化及應用"；山東省教育廳基金項目(llLC53)

姜會民(1976-)男，碩士，講師，研究方向：水產動物毒理；E-mail：50694731@qq.com

10.7524/AJE.1673-5897-20140526003

2014-05-26錄用日期：2014-07-09

1673-5897(2014)5-998-06

： X171.5

： A

姜會超. 氯化汞對鯉幼魚鰓組織抗氧化系統和組織損傷研究[J]. 生態毒理學報，2014, 9(5): 998-1003

Jiang H C. Effect of mercury chloride on antioxidant system and injury in gill of carps [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(5): 998-1003 (in Chinese)