高住低練對大鼠骨髓促紅細胞生成素受體蛋白表達的影響

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(湖南第一師范學院 體育系，湖南 長沙 410012)

高住低練對大鼠骨髓促紅細胞生成素受體蛋白表達的影響

曹蕾，鄭瀾，皮亦華

(湖南第一師范學院 體育系，湖南 長沙 410012)

研究目的：探討高住低練對大鼠骨髓細胞促紅細胞生成素受體(Erythropoietin receptor, EpoR)蛋白表達的不同作用。研究方法：本研究將健康雄性SD大鼠56只隨機分為7組，采用免疫組織化學及計算機顯微圖像分析，檢測EpoR在骨髓組織中的含量，分析運動和低氧2種不同的處理因素對骨髓EpoR蛋白表達的效應。研究結果：高住低練和低住低練都可使EpoR蛋白表達增加。高住低練中隨著訓練時間的延長，EpoR增加更明顯。結論：隨著低氧和訓練因素的影響，EpoR蛋白有逐漸上升的趨勢，模擬高住低練能使EpoR蛋白表達加快。

高住低練；促紅細胞生成素受體蛋白；免疫組織化學

促紅細胞生成素(Erythropoietin, Epo)和促紅細胞生成素受體(Erythropoietin receptor, EpoR)與運動訓練關系的研究是從研究高原訓練開始的。而在對高原訓練的研究中發現在諸多影響運動成績的因素里，缺氧對機體的刺激造成紅細胞和血紅蛋白的增加是最主要的因素。事實證明高住低練的訓練模式與高原訓練一樣也可以明顯地提高運動員的成績[1]，而且由于低海拔高氧含量的訓練可以上強度，高住低練的方法甚至優于傳統的高原訓練。許多研究認為這是由于這種訓練方法能通過身體缺氧刺激改變血漿Epo的量，Epo與其受體EpoR結合后發揮生物效力，使外周血中紅細胞數和血紅蛋白含量升高，從而提高最大吸氧量，但近年來的對血漿中Epo的研究并未取得一致結果，因此，我們試圖通過探明EpoR蛋白表達的規律來證實高住低練與紅系細胞的關系，本研究就以高住低練的訓練方式來研究在不同低氧時間和遞增運動強度下EpoR蛋白表達的變化，進一步明確EpoR在低氧訓練中對紅系細胞生成的影響機制，為運動實驗提供依據。

1 研究對象與方法

1.1 實驗對象

表1 本研究大鼠分組情況

健康雄性2.0月齡Sprague-Dawley大鼠56只，體重約200g(由中南大學湘雅醫學院動物學部提供)。用國家標準嚙齒類動物飼料飼養，生活期間室溫保持20～23 ℃，相對濕度45～55%，每天光照12 h。適應性喂養一周后，隨機分為7組，每組8只(表1)

1.2 實驗內容

1.2.1 訓練方案

采用杭州立泰科技有限公司PT動物實驗跑臺訓練，共13天，每天一次，運動強度依據Bedford所建立的運動負荷模型[2]，訓練時間為每晚18:00～22:00，詳細訓練方案見表2。

表2 訓練方案(速度×時間)

1.2.2 低氧安排

采用美國Hypoxico公司的低氧裝置，用美國產TOXIRAE PGM-36型氧氣監測儀實時監測低氧艙中氧含量的變化，并向低氧艙中充入純氮氣以保持氧分壓為11.3 kPa，每天訓練后即刻置于低氧艙中6h[3-4]。

1.3 標本制備

運動訓練方案結束后，將實驗大鼠用25%烏拉坦1ml/100g體重麻醉，75%酒精浸泡消毒后取材。后將大鼠呈仰臥位固定于手術臺上，取雙側股骨切斷，取骨髓，涂于明膠處理的玻片上，4%多聚甲醛固定15 min，用0.01%PBS反復沖洗，置于4 ℃冰箱備用。

1.4 測試方法

1.4.1 免疫組織化學方法

免疫組化一抗由SANTACRUZE公司提供，所用工作濃度為1：200，SABC、DAB試劑盒及蘇木素由武漢博士德公司提供即用型。

1.4.2 計算機圖像分析

用美國Imager-pro圖像分析系統。EpoR的表達用陽性單位表示，公式為

1.5 統計分析

2 實驗結果

2.1 鼠骨髓免疫組化及計算機圖像分析

2.1.1 免疫組化觀察結果

使用免疫組化ABC法對大鼠骨髓EpoR進行標記，EpoR定位于細胞膜上，呈圓球狀顆粒，彌散分布。對陽性單位進行統計分析發現在運動時間和強度遞增，低氧時間延長的情況下EpoR的表達也隨之上升，但是運動組即使是常氧運動13天組，其表達的水平仍低于加了低氧因素的3天組。用肉眼觀察到的圖片也可以發現，運動低氧組的EpoR蛋白表達相比相同訓練常氧組的要多(見圖1)：

圖1 骨髓細胞免疫組織化學染色

A.未加一抗的陰性對照片。×40

B.對照組可見少量表達EpoR的細胞(棕色)。×40

C.第2組訓練低氧3天組，可見較多表達EpoR的細胞。×40

D.第3組訓練3天組。×40

E.第4組訓練低氧6天組。×40

F.第5組訓練6天組。×40

G.第6組訓練低氧13天組，可見許多表達EpoR的細胞。×40

H.第7組訓練13天組。×40

2.1.2 計算機顯微圖像分析結果

表3列出了計算機顯微圖像分析得到的陽性單位灰度值。從圖2中可以看出，運動和低氧與對照組相比較，低住低練組和高住低練組的EPOR蛋白表達都上升，但運動3天組的相對對照組來說無統計學意義；在運動組的對比中，運動3天、6天和13天組之間逐漸上升，差異具有顯著性；在高住低練的各組中，高住低練3天組與高住低練6天組之間EpoR蛋白表達的上升差異無統計學意義，運動低氧13天組EpoR的表達與其它兩個低氧組相比顯著升高。高住低練組大鼠骨髓EpoR蛋白表達顯著高于低住低練組。

表3 EpoR蛋白表達免疫組化涂片計算機顯微圖像分析(陽性單位)

圖2 大鼠骨髓EpoR蛋白表達動態變化

3 分析與討論

EpoR是一種跨膜蛋白質，62KD，由507個氨基酸組成，人與鼠有82%的同源性，其結構可分為三部分：胞膜外部分，跨膜區域，胞內區部分[6]。能表達EpoR的細胞主要為：紅系干細胞、巨核細胞的干細胞，另外多種神經細胞亦可表達EpoR。促紅細胞生成素(erythropoietin，Epo)的主要靶細胞就是紅細胞系集落形成細胞(CFU-E)，因而CFU-E具有促紅細胞生成素受體(EpoR)量最多。但其他一些細胞也有EpoR的存在如白血病細胞[9]。EpoR的數目與該細胞對Epo依賴性大小有關。有人證實，所有的CFU-E細胞上均有EpoR，而只有20%的FUE細胞上有EpoR。當紅系細胞逐漸成熟，對Epo的依賴性下降，受體逐漸喪失，到成紅細胞階段只有很少的EpoR不再依賴Epo。

EpoR的表達受多種因素的影響，Grossi等進行體外細胞培養發現重組人紅細胞生成素(Recombinant Hunan Erythropoietin，rhEpo)能促進紅白血病細胞EpoR的表達[8]。近年大量研究發現缺氧可以誘導大腦中EpoR mRNA表達。Spandou等的動物實驗發現持續結扎大鼠一側頸動脈，24 h后腦組織中EpoR mRNA表達顯著提高，提示在缺血缺氧條件下Epo/EpoR系統對神經細胞起著重要的保護作用[9]。Sun等人的實驗也支持這一觀點[10]。Yu X的動物實驗發現，在鼠胚胎腦神經原中，缺氧能使EpoR表達增長10倍[11]。有文獻報道缺氧是Epo產生的強有力刺激因子，也能刺激EpoR在組織中的表達[12]。還有研究證明在腫瘤中EpoR的表達與腫瘤的大小以及內部的缺氧程度有關[13]，Ge RL在海拔1780米、2085米、2454米及2800米高度檢測安靜人群的腎臟供氧情況和血液中Epo的含量，發現進入高原6小時后Epo就開始增加，同時尿的氧分壓呈下降趨勢。在較低的兩個高度(1780米和2085米)上，24小時后尿氧分壓回到了原來的值，但在其它兩個高度上則是持續降低，Epo在2454米的高度上則與尿氧分壓有相反的表現。證明了Epo上升的海拔高度為2100～2500米，人體在1780和2085米海拔經過短期環境適應之后就可以恢復腎組織的供氧，但在相對較高海拔卻可以引起持續的增長[14]。Beleslin- Cokic等發現Epo可以刺激內皮細胞EpoR的增殖和生成[15]。另外，HIF-1等因子也可以誘導EpoR的生成[16]。從而進一步地驗證了高原的缺氧環境對EpoR表達可能產生的影響。

國內外有關運動對骨髓EpoR蛋白表達的研究報道并不多見，有研究認為運動產生的熱量可使大鼠在顱腦損傷等應激狀態下快速表達較多的EpoR[17]，說明運動本身就可以提高EpoR的表達。以上所有這些研究都是在安靜狀態下進行的。趙杰修等在運動性貧血的研究中發現運動性貧血大鼠骨髓中EpoR的mRNA表達顯著低于安靜對照組和運動加營養組[18]。至今尚未見到有關低氧訓練對骨髓EpoR蛋白生成的影響的報道。

本研究采用免疫組織化學及計算機圖像分析系統對EpoR蛋白表達進行半定量分析，結果顯示運動和低氧都能夠使骨髓細胞EpoR蛋白表達逐漸增加，高住低練組大鼠骨髓細胞EpoR蛋白表達水平明顯高于低住不練組和低住低練組，表達的最高峰出現在低氧運動13天組，說明高住低練能促進大鼠骨髓細胞EpoR蛋白的表達，并且隨著運動和低氧時間的延長對EpoR蛋白表達有累積作用。在運動訓練3天組與安靜對照組之間差異無統計學意義，這可能說明3天的運動訓練不能影響骨髓細胞EpoR蛋白表達。這是否意味著低氧訓練可以使EpoR蛋白表達的增加提前出現，并且出現更高的峰值；在峰值出現之后是否會出現下降或維持特定水平，還有待進一步的研究。

4 結論

4．1 骨髓EpoR蛋白表達隨著低氧和訓練因素的影響，EpoR蛋白表達有逐漸上升的趨勢，模擬高住低練能使EpoR蛋白表達加快。

4．2 模擬高住低練實驗13天的實驗中，EpoR蛋白表達隨時間延長而得到積累，在實驗中沒有峰值的出現。

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Influence of living high and training low on erythropoietin receptor of rat bone marrow

CAO Lei, ZHENG Lan, PI Yi-hua

(1.College of Physical Education, Human Normal University, Changsha 410012, Hunan,China;2. Hunan Institute of Sport Science, Changsha, China)

Objective:To explore the effect of different training pattern and hypoxic stimulus on protein expression of hypoxia induced erythropoietin receptor on bone marrow.Methods:56 male SD rats were randomly divided into 7 groups. Immunohistochemical technology and computer image processing method were applied to exam the content of erythropoietin receptor on bone marrow, and the effect of hypoxia and training on rat bone marrow erythropoietin receptor were analyzed.Results:Erythropoietin of bone marrow was increased in both high-altitude living but low-altitude training group and low-altitude living and low-altitude training group.With the extending of training time, the increase of erythropoietin receptor was obvious.Conclusion:Living-high training-low could increase the protein expression of erythropoietin receptor.

living-high training-low; erythropoietin receptor; immunohistochemistry; bone marrow

2014-02-25

曹蕾(1980- )，女，湖南人，講師，碩士，研究方向運動人體科學。

A

1009-9840(2014)06-0072-04