基因型檢測對診斷乙型肝炎病毒感染程度的價值＊

吳 意，甘 霖，黎村艷，蔣 琰，李 原

（1.湖南省人民醫(yī)院檢驗科，長沙 410005；2.重慶市衛(wèi)生信息中心 400014）

乙型肝炎病毒（HBV）為一種雙鏈DNA病毒，主要由3 200個堿基對構(gòu)成，有研究表明，HBV基因型存在明顯的地域差異［1－3］。為分析HBV基因型檢測的臨床價值，選取湖南省人民醫(yī)院2011年1月至2013年8月收治的433例HBV感染者，檢測HBV的基因型、DNA載量和HBV的E抗原。

1 資料與方法

1.1 一般資料 湖南省人民醫(yī)院2011年1月至2013年8月收治的433例 HBV感染者，年齡18～82歲，平均（45.26±18.6）歲，其中男298例，女135例。感染者均符合2000年全國病毒性肝炎學(xué)術(shù)會議所制定的《全國病毒性肝炎防治方案》中有關(guān)乙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)：DNA表達(dá)載量大于1.0×104copy／mL，ALT＞40U／L，AST＞40U／L。排除其他疾病，同時排除酗酒、吸毒、妊娠、哺乳的患者。輕中度乙型肝炎患者289例（臨床表現(xiàn)為肝功能輕度異常，HBV指標(biāo)為陽性），重度乙型肝炎患者144例（肝功能嚴(yán)重異常）。本次研究獲得患者及家屬知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 儀器：PE7500型全自動熒光定量PCR儀（美國ABI公司生產(chǎn)），雜交爐（深圳亞能生物制品有限公司生產(chǎn)），全自動酶免疫分析儀（瑞士哈數(shù)頓公司）。試劑：PCR－反向點雜交法基因型檢測試劑盒（達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)）。HBV－DNA試劑盒（長沙盛湘公司生產(chǎn)）。HBV E抗原檢測試劑盒（北京萬泰生物醫(yī)藥有限公司）。

1.2.2 HBV－DNA表達(dá)載量測定 HBV－DNA按照試劑盒說明書操作：一步法提取DNA，反應(yīng)體系，總體積40μL，包括樣本5μL，50℃2s，94℃5s，94℃15s，57℃31s，25℃10s，40個循環(huán)。同時作陰陽對照各1管及標(biāo)準(zhǔn)對照4管。

1.2.3 基因分型 一步法提取DNA產(chǎn)物，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，93℃6s預(yù)變性；93℃30s，58℃40s，72℃45s，10個循環(huán)；93℃ 30s，56 ℃ 40s，72 ℃ 45s，10個循環(huán)；93 ℃ 30s，55℃40s，72℃45s，15個循環(huán)。72℃7min。將探針通過氨基酸結(jié)合硝酸纖維膜；產(chǎn)物95℃，10min；膜與DNA雜交，洗脫未雜交的PCR產(chǎn)物；特異性雜交產(chǎn)物5′端與過氧化物酶（POD）結(jié)合，顯色出現(xiàn)藍(lán)色斑點。

1.2.4 HBV E抗原的檢測 血清50μL，同時加入陽性對照和陰性對照，加50μL酶標(biāo)液，混勻37℃30min，洗板5次，加入A液、B液各50μL，混勻37℃15min，終止液50μL，空白調(diào)零比色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理和分析，計量資料采用表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因分型結(jié)果 HBV感染者基因型分析結(jié)果顯示，B基因型患者295例（68.13%），顯著高于BC混合基因型25例（5.77%）和C基因型113例（26.10%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C基因型患者比例，顯著高于BC混合基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 基因型與DNA表達(dá)載量及HBV E抗原關(guān)系 HBV感染者B基因型HBV E抗原陰性率顯著高于BC混合基因型、C基因型；BC混合基因型HBV E抗原的陰性率顯著高于C基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；DNA表達(dá)載量在3種基因型間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各基因型與DNA表達(dá)載量及HBV E抗原關(guān)系（n＝433）

2.3 基因型與病情嚴(yán)重程度關(guān)系 HBV感染者的病情嚴(yán)重程度與基因型關(guān)系見表2，輕中度乙型肝炎患者B基因型比例最高（87.20%），其次為C基因型（9.34%）和BC混合基因型（3.46%）。重度乙型肝炎患者C基因型比例最高（77.08%），其次為BC混合基因型（14.58%）和B基因型（8.33%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝43.52，P＜0.05）。

表2 患者病情嚴(yán)重程度與基因型的關(guān)系［n（%）］

3 討 論

乙型肝炎是常見的一種血液傳播性疾病，該病在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率，由于基因型的不同，病毒DNA復(fù)制能力和免疫逃逸的能力也有差異［4－7］，這是導(dǎo)致不同基因型的HBV感染率呈現(xiàn)出了一定的地域流行的特性［8－10］。已知的HBV基因型共分為9種，分別為：A、B、C、D、E、F、G、H、I［11－13］。在 我 國，HBV 基 因 型 主 要 為 B 基 因 型 與 C 基 因型［14－16］。

本研究表明，B基因型患者比例明顯高于BC混合基因型和C基因型。BC混合基因型患者比例明顯低于C基因型。說明B基因型與C基因型是湖南地區(qū)的高發(fā)基因型，其中B基因型的爆發(fā)率高于C基因型。與張韌等［5］報道的結(jié)果相似。

按照基因型不同，B基因型患者HBV E抗原陰性率明顯偏高，BC混合基因型、C基因型患者HBV E抗原陰性率顯著偏低（P＜0.05），此結(jié)論與有關(guān)研究相似［17］。同樣，按照基因型不同，DNA表達(dá)載量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明不同基因型的HBV載量無差別［18－19］。按照基因型不同，輕中度HBV感染者B基因型比例最高（87.20%），其次為C基因型（9.34%）和BC混合基因型（3.46%）。重度HBV感染者C基因型比例最高（77.08%），其次為BC混合基因型（14.58%）和B基因型（8.33%），說明HBV基因型檢測有助于分析患者病情的嚴(yán)重程度，輕中度乙型肝炎以B基因型為主，重度乙型肝炎以 C基因型為主［20－21］。

綜上所述，HBV基因型與感染的嚴(yán)重程度及E抗原陰性率有關(guān)，與DNA表達(dá)載量無關(guān)。

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