超高效液相色譜質譜聯用技術快速檢測二甲基甲酰胺職業接觸者血紅蛋白中新型生物標志物

王春民　劉強　李建　徐波　米凱　程娟

摘要建立了二甲基甲酰胺（N，Ndimethyl formamide，DMF）職業接觸者血紅蛋白中N甲基氨甲酰加合物超高效液相色譜質譜聯用（UPLC/MS/MS）快速檢測方法。準確稱取0.1 g 血紅蛋白樣品置于15 mL離心管中，加入40 μmol/L 3甲基異丁基海因（3methy5isobutylhydantion，MIH）內標溶液250 μL，再加入HCl醋酸（2∶1， V/V）溶液4.75 mL，振蕩混勻3 min。將試管置于沸水浴中加熱降解1 h，取出冷卻。混勻后取200 μL到96孔板，加入600 μL1%甲酸乙腈溶液，混勻。控制真空泵壓力，使樣品在2～4 min流出。將凈化后樣品混勻轉移到樣品瓶，用UPLC/MS/MS檢測N甲基氨甲酰加合物的降解產物3甲基異丙基乙內酸脲（3Methyl5isopropylhydantoin， MVH）。質譜采集方式為多反應監測模式，內標法定量。結果表明，MVH濃度在0.01～1.0 μmol/L范圍內線性關系良好，相關系數為0.999。空白人群血紅蛋白MVH加標回收率為97.3%，相對標準偏差為1.7%，血紅蛋白中MVH檢出限為0.01 μmol/g。本方法能很好地應用于二甲基甲酰胺職業接觸者血紅蛋白中新型生物標志物N甲基氨甲酰加合物的快速、準確測定。

關鍵詞超高效液相色譜質譜； 二甲基甲酰胺； N甲基氨甲酰加合物； 3甲基異丙基乙內酸脲； 生物標志物

1引言

N，N二甲基甲酰胺（N，Ndimethyl formamide， DMF），簡稱二甲基甲酰胺，是一種透明液體，能與水及大部分有機溶劑互溶，因其具有很強的溶解能力，又被稱為“萬能有機溶劑”，它是化學反應的常用溶劑＼[1＼]。作業場所DMF主要經呼吸道及皮膚進入機體，對肺臟、肝臟及腎臟等器官造成損害，嚴重者可導致死亡＼[2，3＼]。DMF已經成為我國工業中毒中常見的毒物之一。開展DMF生物標志物研究，尤其是接觸標志物研究，對于預防和控制作業場所DMF中毒，保護勞動者的健康具有重要意義。近年來，越來越多的研究表明，DMF體內代謝產物異氰酸甲酯（Methylisocyanate，MIC）與血紅蛋白相互作用形成的加合物N甲基氨甲酰加合物（Nmethylcarbamoyl adduct）可作為反映DMF職業暴露水平的生物標志物＼[4～9＼]。由于人體血液紅細胞更新時間長達4個月，加合物一旦形成，在較長的時間內可維持相對穩定的水平。目前，關于血液中N甲基氨甲酰加合物的檢測，可通過埃德曼降解法，將加合物降解為3甲基異丙基乙內酸脲（3Methyl5isopropylhydantoin，MVH），運用氣相色譜質譜法、氣相色譜法進行測定＼[9，10＼]。超高效液相色譜質譜聯用技術應用于二甲基甲酰胺職業接觸者血紅蛋白中新型生物標志物N甲基氨甲酰加合物檢測尚未有報道，本研究建立了DMF新型生物標志物N甲基氨甲酰加合物的測定方法，具有快速、高通量等優點。DMF職業暴露人群血紅蛋白經埃德曼降解后生成MVH，用96孔板快速凈化，超高效液相色譜質譜檢測，以3甲基異丁基海因（3Methy5isobutylhydantion，MIH）為內標進行定量分析。DMF體內代謝及N甲基氨甲酰加合物埃德曼降解成MVH過程如圖1所示。

[TS（]圖1N，N二甲基甲酰胺代謝并降解成3甲基異丙基乙內酸脲

Fig.1Schemesfor the metabolization and degradation of N，Ndimethyl formamide （DMF） to 3methyl5isopropylhydantoin （MVH）[HT5][TS）]

2實驗部分

2.1儀器與試劑

UPLCQuattro Micro超高效液相色譜三重四級桿質譜聯用儀（美國Waters公司）；Multi Reax振蕩器（德國 Heidolph公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；V700真空泵，V855真空控制系統（瑞士Buchi公司）；Ostro 25 mg 96孔提取板，2 mL 96孔收集板，聚丙烯96孔板蓋墊，96孔板真空提取裝置（美國Waters公司）。

HCl（優級純）、冰醋酸（分析純）、甲酸（色譜純）、乙腈（色譜純）、MVH標準品（湖南化工研究院提供）、MIH標準品（湖南化工研究院提供），實驗用水為超純水。

2.2血紅蛋白制備

用肝素抗凝的采血管收集血樣5 mL，離心15 min，棄去血漿；用生理鹽水洗紅細胞兩次，然后用1 mL蒸餾水在超聲狀態下裂解紅細胞；緩慢加入15 mL預冷丙酮溶液（含有2% HCl）；沉降蛋白離心5 min，棄去上清液，再用15 mL上述丙酮溶液清洗3次，最后用15 mL乙酸乙酯清洗，剩余物以氮氣吹干。樣品采集后及時處理成血紅蛋白備用。

2.3樣品處理

準確稱取約0.1 g 血紅蛋白置于15 mL離心管中，加入40 μmol/L MIH內標溶液250 μL，再加入鹽酸醋酸（2∶1， V/V）溶液4.75 mL，振蕩混勻3 min。將試管置于沸水浴中加熱降解1 h（反應過程可能會產生氣泡，小心操作），取出冷卻。混勻后取200 μL到96孔板，加入600 μL 1%甲酸乙腈溶液，混勻。控制真空泵壓力，使樣品在2～4 min流出。將凈化后樣品混勻轉移到樣品瓶中待測。

2.4標準溶液配制

2.5色譜質譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸（A）和乙腈（B），流速0.25 mL/min，柱溫35 ℃。采用梯度洗脫：0～3 min，90%～10% A；3～3.2 min，10% A；3.2～3.5 min，10%～90% A；3.5～4.0 min，90% A。進樣量5 μL。

采用ES+電噴霧電離源模式，毛細管電壓3.5 kV；萃取錐孔電壓3.0 V；源溫度120 ℃；脫溶劑溫度380 ℃；脫溶劑氣流速800 L/h；四極桿低（高）端分辨率13.0；檢測方式為多反應監測掃描模式（MRM）。

3結果與討論

3.1前處理過程

氣相色譜質譜聯用法檢測時樣品前處理過程采用酸降解、調節酸度、乙酸乙酯提取靜置過夜、氮吹、定容等多個步驟，方法耗時長，前處理復雜＼[10＼]。為快速進行血紅蛋白中MVH檢測，前處理方法必須簡單有效。用96孔板進行實驗，將待測樣品取樣后加入內標并進行酸降解，取200 μL降解液到96孔板，加入600 μL 1%甲酸乙腈混勻后減壓過板，收集濾出液并轉移到樣品瓶中待測。此法步驟少，可同時處理96個樣品，提高了樣品通量，符合快速檢測要求。

DMF在人體內經過代謝形成中間產物，此時血紅蛋白必須通過埃德曼降解法產生MVH，即沸水浴酸降解為必要步驟。比較酸降解后溶液和進一步調節pH值后， 溶液用96孔板處理，峰面積差異不大，但是經過酸度調節的樣品過板后會析出沉淀，易堵住進樣針和流路系統，故酸降解后不調節酸度較好。在此情況下，上樣200 μL到96孔板，比較加入600 μL 1%甲酸乙腈和600 μL 5%氨化甲醇的降解效果，結果顯示，

3.296孔板與固相萃取柱的比較

采用HLB固相萃取柱處理經埃德曼降解后的樣品，洗脫液直接進入LC/MS/MS分析，并與經96孔板處理樣品比較，樣品圖譜無明顯差異。但檢測大量樣品時，過HLB固相萃取柱步驟復雜、耗時長、通量小、成本高，故選擇96孔板進行樣品凈化。

3.3基質效應和內標法

降解后的血紅蛋白基質復雜，經過凈化去除磷脂蛋白等雜質，但進樣后有離子抑制效應，且目標物降低顯著。在相同條件下，連續進樣（n=6），比較同濃度標準溶液與在空白人群基質加標并前處理的溶液。同樣濃度不同基質的離子抑制情況如圖2所示，離子抑制效應使得外標法不能準確定量，應選擇內標法。由于MVH由MIC與纈氨酸合成，MIH由MIC與異亮氨酸合成，兩者結構類似，物理化學性質接近，符合內標物的選擇條件，故選擇MIH作為MVH內標。

3.7樣品測定

采集某企業DMF職業暴露人群血液樣品441份，將血液樣品按照2.2節及時制備成符合要求的血紅蛋白，備用。將血紅蛋白按照本法用96孔板前處理并以超高效液相色譜質譜聯用儀檢測，結果表明，對照人群血紅蛋白樣品中MVH均未檢出。職業暴露人群根據崗位不同，在DMF中暴露程度不同，血紅蛋白中MVH含量在0.01～0.18 μmol/g范圍內，結果分布情況如圖4所示。空白對照人群和DMF職業暴露人群新型生物標志物N甲基氨甲酰加合物降解產物MVH檢測對比如圖5所示。

4結論

通過96孔板凈化，超高效液相色譜質譜聯用技術快速檢測DMF職業暴露人群血紅蛋白中新型生物標志物，取樣后前處理只需2 h左右，單個進樣運行只需4 min。與已報道的方法相比，本方法方便快速，通量高，在進行大批量樣品分析時，能準確及時檢測，可以節省大量時間和人力財力。 本方法能準確、快速測定DMF職業接觸者血紅蛋白中新型生物標志物N甲基氨甲酰加合物。

References

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10WANG ChunMin， LIU Qiang， LI Jian， YAO JianHua， MI Kai， XU Bo， HUANG Lu. Industrial Health and Occupational Diseases， 2011， 37（6）： 381-383

王春民， 劉 強， 李 建， 姚建華， 米 凱， 徐 波， 黃 路. 工業衛生與職業病， 2011， 37（6）： 381-383

AbstractA rapid analytical method was developed for the determination of Nmethylcarbamoyl adduct in Hemoglobin of workers exposed to N，Ndimethylformamide by ultra high performance liquid chromatographymass spectrometry （UPLC/MS/MS）. About 0.1 g of hemoglobin sample， 40 μmol/L of 3methyl5isopropylhydantoin （MIH） as the internal standard and 4.75 mL of HClacetic acid （2∶1， V/V） were added in the centrifuge tube， and mixed for 3 min. Then the tube was heated in boiling water bath for 1h. After cooling down， 200 μL of the mixture and 600 μL of formic acidacetonitrile （1%） were added into 96well extract plate. The vacuum pump pressure was controlled to make the sample collection elute within 2-4 min. The purified collection was transferred into the sample vial， and 3methyl5isopropylhydantoin （MVH） as degration product of Nmethylcarbamoyl adduct was quantified by UPLC/MS/MS in multiple reaction monitoring （MRM） by internal standard method. A good linear relationship was obtained in the MVH concentration range of 0.01-1.0 μmol/L with the correlation coefficient of 0.999. The recovery of added MVH in the blank sample was 97.3% and the relative standard deviation was 1.7%. The limit of detection （LOD） was 0.01 μmol/g. This method was proved to be fast and efficient.

KeywordsUltra high performance liquid chromatographymass spectrometry； N，NDimethylformamide； NMethylcarbamoyl adduct； 3Methyl5isopropylhydantoin； Biomarker

10WANG ChunMin， LIU Qiang， LI Jian， YAO JianHua， MI Kai， XU Bo， HUANG Lu. Industrial Health and Occupational Diseases， 2011， 37（6）： 381-383

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KeywordsUltra high performance liquid chromatographymass spectrometry； N，NDimethylformamide； NMethylcarbamoyl adduct； 3Methyl5isopropylhydantoin； Biomarker

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KeywordsUltra high performance liquid chromatographymass spectrometry； N，NDimethylformamide； NMethylcarbamoyl adduct； 3Methyl5isopropylhydantoin； Biomarker