季銨鹽化納米金剛石肌紅蛋白修飾電極的電化學行為

馬曉玲　丁承君　張璞　郭瑋　羅紅霞

摘要通過一系列的化學反應對納米金剛石（ND）表面進行修飾，成功制備了季銨鹽化納米金剛石： NDCONHCH2CH2N（CH3）3+·I Symbolm@@ （QASND），通過FTIR、元素分析、電化學等手段對目標產物QASND進行了表征。將肌紅蛋白（Mb）與QASND混合液滴加在玻碳（GC）電極表面，制備QASND/Mb/GC修飾電極。在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液 （pH 7.0）中，固定在膜內的Mb表現出良好的直接電化學性質，并顯示了很好的穩定性。同時，探討了此修飾電極表面固定的Mb對H2O2的催化還原，結果表明，此修飾電極可作為H2O2生物傳感器，實現對H2O2的快速、準確檢測，檢出限為 3.5 μmol/L （S/N=3）。

關鍵詞季銨鹽化納米金剛石；肌紅蛋白；化學修飾電極；循環伏安法；過氧化氫

1引言

納米金剛石（ND）是納米材料家族中的重要成員，它不僅具有納米材料的獨特性質，還保留著金剛石優異的電化學性能，如電位窗口寬、背景電流低，高的化學、電化學穩定性和優越的抗腐蝕性等，同時由于其巨大的比表面積、表面大量的含氧官能團＼[1，2＼]使它成為一種優良的電極材料。但是由于尺寸效應、表面效應、表面電子效應和近距離效應， 使ND容易發生團聚，阻礙了它在一些領域的應用，ND的表面修飾為ND解團聚進而提高其電化學性能提供了一種很好的解決方案。

由爆轟法制備的ND表面帶有大量官能團，如COOH， OH，CO等，因而可以通過一系列的化學反應使其表面引進新的官能團，改善其性能，增強它的電化學活性。關于ND的表面修飾，已有較多研究。Liu等＼[3＼]將ND氟化，再將其烷基化、氨基化；Tkachenko等＼[4＼]將ND表面巰基化后，使它能夠在金表面單層自組裝，開拓了ND在電鍍及納米電子領域的應用； Krueger等＼[5＼]將ND硼烷化后，再與3氨基丙基三甲氧基硅烷反應，生成帶有硅氧鍵的ND， 然后共價接枝生物素，并研究它與HRPSA的結合活性，為ND在醫學領域以及電化學傳感器領域的應用奠定基礎；Mochalin等＼[6，7＼]將ND羧基化、酰氯化后，接上十八烷基胺，生成的帶有長碳鏈ND產物可以較均勻分散在有機溶劑中，并在紫外光下發出藍色的熒光，為其作為藥物載體提供了可能。

肌紅蛋白（Mb）是由一條肽鏈和一個血紅素輔基組成的結合蛋白，是肌肉內儲存氧的蛋白質。Mb是組成骨骼肌和心肌的主要蛋白質，位于肌肉的肌細胞中，其功能是可逆地結合氧氣，將氧氣貯存于肌肉細胞中。Mb表現出的生理功能及參與的代謝過程，大多數涉及電子傳遞過程，因此用電化學方法研究 Mb的氧化還原反應及類酶性質，具有得天獨厚的優勢。同時，Mb由于相對便宜易得，是研究血紅素蛋白質和酶的電子傳遞反應的理想模型物＼[8＼]。在過去的幾十年中，人們通過各種努力將Mb固定到不同的修飾電極表面來研究其直接電化學＼[9＼]。最近， Mani等＼[10＼]將還原的氧化石墨烯多壁碳納米管/Pt納米粒子納米復合材料與Mb一起修飾到玻碳（GC）電極表面，得到了Mb的直接電化學響應，并研究了該修飾電極對H2O2和NO

2的傳感作用。但是，Mb在ND表面的電化學行為尚未見報道。

本課題組報道過ND修飾電極的電化學性質及其對某些生物分子電極反應的促進作用＼[11＼]。本研究通過一系列化學反應，對ND進行表面修飾，制備出季銨鹽化ND（QASND）： NDCONHCH2CH2N（CH3）+3·I

然后將QASND分散到Mb溶液中，以滴涂方式制成 QASND/Mb/GC 修飾電極，研究了修飾電極中Mb的直接電化學行為，及對H2O2的電化學傳感作用。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

紅外光譜儀（BioRad FTS 6000），元素分析儀（Elementar Vario MICRO CUBE， Germany），Epsilon電化學工作站（美國BAS公司），pH 計（（Sartorius PB10， Germany）。三電極系統： 工作電極為GC或修飾后的GC電極（

參比電極為Ag/AgCl電極，對電極為Pt絲電極

納米金剛石（ND， 深圳市金剛源新材料發展有限公司贈送）； N，N二甲基乙二胺、碘甲烷、二氯亞砜（分析純）， 使用前重蒸； 馬心肌紅蛋白 （Mb， MW 17800），Nafion （2% Ethanol solution）， 購自Sigma公司； H2O2（30%），0.1 mol/L KH2PO4Na2HPO4緩沖溶液（PBS）作為支持電解質，電位掃描速率為100 mV/s （特殊指明除外），實驗前均用高純N2除氧20 min，實驗用水為MilliQ去離子水（Millipore公司）。

2.2QASND的制備

2.2.1ND的羧基化ND表面除了帶有大量的含氧基團之外，還會帶有大量可活化的甲基或亞甲基基團，所以在使用前要經過酸化氧化處理，以增加其表面的羧基含量。將100 mg ND溶在50 mL H2SO4HNO3（9∶1， V/V）中，90 ℃時回流氧化7 d，再用去離子水反復洗滌至中性，在真空干燥箱中烘干得到羧基化ND，即NDCOOH。反應如下：

NDH2SO4HNO3（9∶1）refluxNDCOOH（1）

2.2.2ND的酰氯化 將NDCOOH與20 mL重蒸后的二氯亞砜（SOCl2）中，在90℃條件下加熱回流24 h，使其表面的羧基酰氯化，反應完成后將所得產物用旋轉蒸發儀旋干， 置于真空干燥箱中干燥備用。所得產物即酰氯化的ND（NDCOCl）。

2.2.3ND的酰胺化經真空干燥的NDCOCl與5 mL N，N二甲基乙二胺混合后在氮氣保護下，加熱至約100℃ 攪拌反應96 h。產物離心后得到的固體物用乙醇和去離子水多次洗滌，離心，得到固體＼[NDCONHCH2CH2N（CH3）2＼]， 即AND，在真空干燥箱中烘干。反應如下：

NDCOOH+NNH2N2100 ℃， 96 hCONDNHNAND（2）

2.2.4ND的季銨鹽化經真空干燥的AND與1 mL 碘甲烷在新蒸丙酮溶液中加熱至75℃ 攪拌回流24 h。離心后用乙醇洗滌多次，得到固體＼[NDCONHCH2CH2N（CH3）3+·I

2.3修飾電極的制備

稱取10 mg Mb溶于1 mL去離子水中，取1 mg QASND分散于上述溶液中，超聲混合均勻。玻碳電極用0.3 μm的氧化鋁粉末拋光，然后分別用去離子水和無水乙醇超聲清洗。用微量進樣器取3 μL上述混合液滴加到預先處理好的GC電極表面，自然晾干。為防止Mb溶解于水中，滴加2 μL 2% Nafion乙醇溶液到電極表面，待溶劑揮發完全后即得到Nafion/QASND/Mb/GC修飾電極。用類似方法可以分別制得Nafion/QASND/GC修飾電極和Nafion/Mb/GC修飾電極。

3結果與討論

3.1QASND的表征

是羰基的振動吸收峰。在1300～1500 cm處復雜的吸收譜帶是CN，NH和COC等基團的譜峰相互疊加的結果＼[12＼]，這也說明ND表面本身含有一定量的N元素＼[18＼]。ND表面修飾前后FTIR圖譜的變化表明ND已經季銨鹽化。3.1.2元素分析表征表1是 ND和QASND的元素分析結果。從表1可見，QASND的N元素和H元素含量都約為ND的N元素和H元素含量的2倍，進一步證明季銨鹽已經連接到ND上。3.1.3電化學方法表征將GC電極、ND膜修飾電極、QASND膜修飾電極浸泡在5 mmol/L K3Fe（CN）6溶液中5 min，將電極取出，用去離子水反復沖洗電極表面，然后分別在空白PBS中進行循環伏安掃描。如圖2A所示，GC電極上沒有任何氧化還原峰，說明裸電極對K3＼[Fe（CN）6＼]的吸附作用很弱；ND膜修飾電極上出現一對氧化還原峰，但是峰電位差較大，峰電流較小，可逆性很差，表明ND與 K3＼[Fe（CN）6＼]之間的作用力較弱，吸附在修飾電極表面的K3＼[Fe（CN）6＼]的量較小；QASND膜修飾電極上出現了一對非常可逆的氧化還原峰，峰電位差較小，峰電流很大，說明QASND與 K3＼[Fe（CN）6＼]之間的作用力很強，K3＼[Fe（CN）6＼]很容易吸附在QASND表面，這可能是因為QASND表面帶正電荷，Fe（CN）6帶負電荷，通過正負電荷之間強的靜電作用，K3＼[Fe（CN）6＼]很好地固定在電極表面。這也進一步說明季銨鹽已經連接在ND上，表面帶正電荷，從而能夠通過強的靜電作用吸附K3＼[Fe（CN）6＼]。考察了電位掃描速率對Nafion/QASND/Mb/GC中Mb電化學行為的影響，圖4為掃速分別是100， 200， 300， 400， 500和600 mV/s時的循環伏安圖。隨著掃描速率的增大，峰電位沒有明顯變化，峰電流逐漸增大。繼續逐步加大掃速至2.0 V/s，峰電位依然沒有明顯變化，峰電流與掃描速率的關系如圖4內插圖所示，還原和氧化峰電流均與掃描速率呈線性關系，線性方程分別為IPc （μA）=2.5836v（V/s） + 0.1259 （r=0.999） 和通過紅外光譜、元素分析實驗及電化學手段進行表征，證明合成了目標產物QASND。將QASND與Mb混合滴加在玻碳電極表面，并以Nafion膜進行保護，制備了Nafion/QASND/Mb/GC修飾電極，實現了Mb活性中心與電極間的直接電子轉移。進一步的實驗表明，Nafion/QASND/Mb/GC修飾電極對O2以及H2O2具有靈敏的電化學傳感作用，可作為H2O2生物傳感器，實現對H2O2的快速、準確檢測，檢出限為3.5 μmol/L （S/N=3）。與其它類似修飾電極＼[9，10＼]相比，Nafion/QASND/Mb/GC電極修飾制備簡單，原材料ND價廉易得，便于推廣和應用。References

1Sarada B V， Rao T N， Tryk D A， Fujishima A. New Diamond and Frontier Carbon Technology， 1999， 9（5）： 365-377

2Rao T N， Yagi I， Miwa T. Anal. Chem.， 1999， 71（13）： 2506-2511

3Liu Y， Gu Z N. Margrave J L， Khabashesku V N. Chem. Mater.， 2004， 16（6）： 3924-3930

4Tkachenko B A， Fokina N A， Chernish L V， Dahl J E P， Liu S G， Carlson R M K， Fokin A A， Schreiner P R. Org. Lett.， 2006， 8（9）： 1767-1770

5Krueger A， Stegk J， Liang Y J， Lu L， Jarre G. Langmuir.， 2008， 24（8）： 4200-4204

6Mochalin V N， Gogotsi Y. J. Am. Chem. Soc.， 2009， 131（13）： 4594-4595

7Mochalin V N， Neitzel I， Etzold B J M， Peterson A， Palmese G， Gogotsi Y. ACS Nano.， 2011， 5（9）： 7494-7502

8Liu S， Ju H. Electroanal.， 2003， 15（18）： 1488-1493

9Yue R， Lu Q， Zhou Y. Biosens. Bioelectron.， 2011， 26（11）： 4436-4441

10Mani V， Dinesh B， Chen S M. Saraswathi R. Biosens. Bioelectron.， 2014， 193（53）： 420-427

11Li Y S， Luo H X， Dai L M， Guo W， Li S N， Guo Z X. Sci. Chin. Chem.， 2012， 55（11）： 2445-2449

12JIANG XiaoHong， WANG ZhiCheng， HUANG YinSheng， YANG XuJie， Aleksahdrovich S V， LU LuDe， WANG Xin. J. Nanjing University Sci. Tech.， 2007， 31（4）： 523-527

江曉紅， 王志成， 黃寅生， 楊緒杰， Aleksahdrovich S V， 陸路德， 汪 信. 南京理工大學學報， 2007， 31（4）： 523-527

13Miao X， Liu Y， Gao W C， Hu N F. Bioelectrochem.， 2010， 79（2）： 187-192

AbstractThrough a series of chemical reactions， a kind of quaternary ammonium salt derivative of nanodiamond， NDCONHCH2CH2N（CH3）3+ ·I

Symbolm@@ （QASND），was obtained ， which was confirmed by FTIR， element analysis experiment and the electrochemistry measurements. Mixed myoglobin （Mb） and QASND solution was dropped on the surface of the glassy carbon （GC） electrode to prepare QASND/Mb/GC modified electrode. In 0.1 mol/L phosphate buffer solution （PBS） （pH 7.0）， Mb in the membrane exhibited direct electrochemical properties and showed good stability. The electrocatalytic property of the modified electrode toward H2O2 was investigated， the results showed that the modified electrode could be used as the H2O2 biosensor to achieve fast， accurate detection of H2O2， with a detection limit of 3.5 mmol/L （S/N=3）.

KeywordsQuaternarized nanodiamond； Myoglobin； Chemically modified electrode； Cyclic voltammetry； Hydrogen peroxide

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KeywordsQuaternarized nanodiamond； Myoglobin； Chemically modified electrode； Cyclic voltammetry； Hydrogen peroxide

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KeywordsQuaternarized nanodiamond； Myoglobin； Chemically modified electrode； Cyclic voltammetry； Hydrogen peroxide