腰椎間盤退變模型的設計

李曉聲，陳鐵柱*，曾焱

(1.湖南省人民醫院骨科，湖南 長沙 410005；2.湖南旺旺醫院骨科，湖南 長沙 410016)

實驗研究

腰椎間盤退變模型的設計

李曉聲1，陳鐵柱1*，曾焱2

(1.湖南省人民醫院骨科，湖南 長沙 410005；2.湖南旺旺醫院骨科，湖南 長沙 410016)

目的建立一種兔腰椎間盤突出癥的動物模型。方法動物隨機分為實驗組、對照組，每組10只，實驗組將0.2 mL無菌0.9%氯化鈉溶液緩慢注入L4～5椎間盤內。對照組椎間盤不穿刺注入，分別于造模后第2、4、8周進行X線檢查后處死，從解剖形態、X線片、組織學觀察椎間盤退變。結果該方法能使椎間盤質地變硬、椎間盤周緣骨贅形成、椎間隙變窄、纖維環纖維排列散亂、髓核消失，2～8周觀察：解剖形態：被注射椎間盤質地逐漸變硬，椎間盤突向椎管內壓迫硬脊膜，脊神經根有黏連，分離困難。椎間盤周緣可見局部骨贅形成，質硬；X線片：腰椎間隙逐漸變窄，骨贅形成，椎間孔狹小；組織學：纖維環逐漸變薄，部分區域纖維層排列散亂，髓核消失，被增生的類骨質、骨質取代。結論選用家兔在直視下行椎間盤內注射0.9%氯化鈉溶液的方法，可成功制備腰椎間盤退變模型。

椎間盤退變；動物模型；0.9%氯化鈉溶液；兔

腰椎間盤突出癥是引起腰背疼痛的主要原因，臨床發病率高，近年來該病呈年輕化趨勢發展，嚴重影響人們的生活及工作。該病發病機制尚未完全清楚，相關研究表明椎間盤退變是其主要原因[1]。為了研究椎間盤退變的機理以及為臨床治療椎間盤突出提供試驗指導，學者們建立了大量動物模型，其中以針刺法最常用。本實驗將針刺法進行改良，以7號腰穿針穿刺兔椎間盤，并注射0.2 mL 0.9%氯化鈉溶液制備兔腰椎間盤退變模型。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 同種、體健家兔20只，年齡0.5～1.0 歲，體重2.5～3.0 kg。由長沙市東創實驗動物科技服務部提供，飼養于湖南省人民醫院臨床研究所清潔級動物實驗室。實驗前分籠喂養2周，以觀察健康狀況。動物房實行7：00～19：00光暗交替，相對濕度40%～70%，溫度18～29℃。

1.2 實驗方法 受趙定麟方法[2]啟示，動物隨機分為實驗組和對照組，每組10只，用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉。仰臥位固定，左下腹部剃毛清洗后，常規消毒鋪無菌孔巾。取左下腹縱切口，長約7 cm，經腹膜外達腰椎前筋膜。鈍性剝離顯露L4S1前方椎體及椎間盤。確定L4～5椎間盤后，實驗組取7號腰穿針將0.2 mL無菌0.9%氯化鈉溶液緩慢注入椎間盤內，深度為0.5 cm，相當于髓核部位。對照組不予以椎間盤穿刺注水，其余步驟同前。逐層縫合傷口，術后分籠自由活動。術后3 d給予青霉素肌注，8萬U/d。

1.3 解剖觀察 分別于造模手術后第2、4、8周末，耳緣靜脈注射空氣10 mL，各組隨機處死3只解剖觀察。每組10只，剩余1只替補兩組試驗動物意外死亡。如兩組均無死亡，第8周處理4只試驗動物。

1.4 X線片檢查 分別于造模后第2、4、8周，各組隨機選出3只予以拍攝腰椎X線片。1.5 組織形態學檢查 造模手術后各組第2、4、8周，耳緣靜脈注射空氣10 mL，各周隨機處死3只，取其L4～5椎間盤，行石蠟切片及HE染色后，光鏡下觀察各時期椎間盤組織形態。

2 結 果

2.1 解剖學觀察結果 對照組：該組各時期椎間盤周緣與毗鄰組織無黏連，椎管內無滲血，椎間盤觸之質韌。實驗組：術后2周：被注射椎間盤周緣與毗鄰組織有黏連，椎間盤觸之稍質硬；術后4周：被注射椎間盤周緣與毗鄰組織黏連緊密，不易分離，椎間盤硬度增加(見圖1)；術后8周：被注射椎間盤成骨樣硬(7號腰穿針難以刺入)，椎間盤突向椎管內壓迫硬脊膜，脊神經根有黏連，分離困難。椎間盤周緣可見局部骨贅形成，質硬(見圖2)。

圖1 實驗組術后第4周肉眼觀察，被注射椎間盤周緣與 毗鄰組織黏連緊密，不易分離，椎間盤硬度增加

2.2 X線片實驗結果

2.2.1 對照組 各期拍片示腰椎間隙正常，椎體邊緣無骨贅形成，椎體骨質密度無明顯改變。

圖2 實驗組術后第8周肉眼觀察，被注射椎間盤成骨樣硬，間盤突向椎管內壓迫硬脊膜，脊神經根有黏連，分離困難。椎間盤周緣課件局部骨贅形成，質硬

2.2.2 實驗組 術后2周：注射后的腰椎間隙尚正常，椎體邊緣椎間隙部位可見局部密度增高影，椎間孔尚無明顯狹窄；術后4周：注射后的腰椎間隙可見變窄，椎體邊緣椎間隙部位骨贅形成，椎間孔可見狹窄改變；術后8周：注射后的腰椎間隙明顯變窄，甚至消失。椎間盤毗鄰椎體邊緣骨質密度增高，骨贅形成，椎間孔狹小。

2.3 組織學觀察結果

2.3.1 對照組 對照組第2、4、8周末，每周隨機處死3只，取其L4～5椎間盤，各時期椎間盤組織學無明顯變化。椎間盤由外周的纖維環及中央的髓核組成。纖維環的外1/3主要是纖維組織，其間含有成纖維樣細胞，并與椎體的軟骨層相連，其間可見有少量的骨小梁；內2/3則為纖維軟骨。椎間盤的纖維排列與人體結構大致相似(見圖3)。

2.3.2 實驗組 術后2周：椎間盤形態規則，纖維層寬厚，排列規整，髓核明顯，椎間盤后緣已開始出現透明軟骨的類骨質。術后4周：總體變化與前者相似，明顯變化是可見纖維組織壞死，被增生的骨質取代(見圖4)。術后8周：椎間盤病理改變明顯，纖維環僅存于椎間盤邊緣，很薄，部分區域纖維層排列散亂，趨向于退變、壞死，髓核消失，被增生的類骨質、骨質取代。有大片透明軟骨和幾個骨質增生區。增生的骨質區域已形成骨髓腔，內有骨髓組織(見圖5)。

圖3 對照組光鏡下顯示椎間盤形態規 圖4 試驗組術后4周，可見纖維組織 圖5 試驗組術后8周髓核消失，被增生

則,纖維環排列規整,髓核明顯(×40) 壞死，被增生的骨質取代(×40) 的類骨質、骨質取代(×40)

3 討 論

3.1 實驗動物選擇 腰椎間盤退變是引起腰腿痛的一個主要因素。構建腰椎間盤退變模型是研究椎間盤退變的病因和病理生理的基礎。良好的椎間盤退變模型需要符合椎間盤退變的規律，所選動物解剖和生理特點盡可能與人類接近，模型重復性好。靈長類解剖生理與人類最為相近，是動物模型最理想的選擇，但由于經濟等原因受到限制，Elliott等[3]發現四肢動物椎間盤特性與人類相似，椎體長軸受力，認為四肢動物可用于椎間盤退變模型的制備。目前多選用鼠、兔、犬、羊等動物。本實驗選用兔為模型動物主要考慮兔椎間盤大小合適，采用針刺法易于制作模型，其髓核和纖維細胞形態改變同人類變化相似，但其退變程度不如人類明顯。雖然兩者存在物種上的差異，但可作為研究椎間盤退變的實驗模型。根據本實驗觀察，造模后實驗兔的腰椎間盤病理性退變與人類相似，基本符合椎間盤退變的模型要求。

3.2 實驗方法選擇 目前建立腰椎間盤退變動物模型主要通過物理、生化的方式改變脊椎生物力學結構或椎間盤及髓核組織化學構成，促使椎間盤出現自發退變，包括改變脊柱負荷或活動、損傷纖維環、破壞脊柱穩定性、酶類/非酶類化學模型以及自發性退變模型，其中以針刺法損傷纖維環最常用[4-6]，該法微創、操作簡便、經濟、見效迅速。本實驗采用針刺法，為確保針刺損傷纖維環，定位準確，予以經腹膜后直視下經棘旁穿刺造模。本次實驗較順利，經解剖觀察、X線片、組織切片觀察，說明椎間盤退變符合實驗造模要求。

3.3 實驗造模的機理 椎間盤退變的原因眾多，研究認為椎間盤退變主要與椎間盤生物力學改變、生活習慣、職業、外傷、細胞因子、炎癥介質、營養代謝障礙、細胞凋亡、缺血缺氧等相關因素有關。腰椎間盤退變的發生與發展是人體在生長發育停止后開始，多于23 歲后開始，纖維環與髓核相繼退變，髓核表現為脫水及吸水功能減退，以致體積減小，彈性降低。在椎間盤內壓力改變時致使壓力分布不均，導致軟骨終板變形損傷，影響椎間盤營養改變，椎間盤組織細胞成分改變等加速椎間盤退變。本實驗造模用注射的方法既可增加局部間隙壓力，又能避免對機體不必要的影響，減少椎間盤退變其他因素影響。

腰椎X線片顯示椎間隙變窄主要是因為椎間盤內容脫出及退行性變所致；在病變鄰近的椎間盤纖維環呈線狀鈣化，可為確診椎間盤纖維環破裂的直接X線象。手術造模2個月后的兔腰椎X線片顯示椎間隙變窄，骨贅形成，椎間隙內線狀鈣化等征象，可基本判定注射后的椎間盤退變，纖維環破壞以及骨化與人的腰椎間盤退變X線片征象具有一致性。肉眼觀察到椎間盤與毗鄰組織黏連，向椎管內突出并與神經根有黏連等，符合腰椎間盤退變的病理過程。鏡下觀察從術后2周至8周的椎間盤組織切片，大體反映了注射0.9%氯化鈉溶液后椎間盤退變的基本過程。此退變過程結合肉眼觀察和X線征象，表明本實驗建立的腰椎間盤退變模型具備形態學改變基礎，模型是可靠的。

綜上所述，選用家兔在直視下行椎間盤內注射0.9%氯化鈉溶液的方法，經解剖觀察、X線片、組織切片觀察，椎間盤退變符合實驗造模要求。能再現椎間盤退行性變的客觀規律，動物模型制作相對簡便，從而模型重復性好；所選動物——兔作為常見的實驗動物，椎間盤結構與人類基本相同，具有經濟性和便利性等優點，為研究腰椎間盤退變提供了一種合適的動物模型。

[1]Masuda K，Aota Y，Muehleman C，etal.A Novel rabbit model of mild，reproducible disc degeneration by an anulus needle puncture：correlation between the degree of disc Injury and radiological and histological appearances of disc degeneration[J].Spine，2005，30(1)：5-14.

[2]趙定麟，陳德玉，沈強，等.實驗性頸椎病模型的設計[J].中華外科雜志，1993，31(8)：453-455.

[3]Elliott DM，Sarver JJ.Young investigator award winner：validation of the mouse and rat disc as disc as mechanical models of the human lumbar disc[J].Spine，2004，29 (7)：713-722.

[4]Zhang H，La Marca F，Hollister SJ，etal.Developing consistently reproducible intervertebral disc degeneration at rat caudal spine by using needle puncture[J].J Neurosurg Spine，2009，10(6)：522-530.

[5]Zhang KB，Zheng ZM，Liu H，etal.The effects of punctured nucleus pulposus on lumbar radicular pain in rats：a behavioral and immunohistochemical study[J].J Neurosurg Spine，2009，11(4)：492-500.

[6]Ragab AA，Woodall JW Jr，Tucci MA，etal.A preliminary report on the effects of sustained administration of corticosteroid on traumatized disc using the adult male rat model[J].J Spinal Disord Tech，2009，22(7)：473-478.

ModelofLumbarIntervertebralDiscsDegeneration

LI Xiao-sheng1，CHEN Tie-zhu1，ZENG Yan2

(1.Department of Orthopaedics，People′s Hospital of Hunan Province，Changsha 410005，China；2.Department of Drthopaedics，Wang Wang Hospital，Changsha 410016，China)

ObjectiveTo establish a model of rabbit lumbar disc herniation.MethodsIn the experimental group，0.2 mL 0.9% saline were slowly injected into L4～5intervertebral disc.We observe lumbar disc degeneration from anatomic form，X-ray，Histology.ResultsThis method stiffened the lumbar disc texture，induced osteophyte periphery to the discs，narrowed the lumbar disc space，dispersed the annulus fibers and made nucleus pulposus vanished.Observation after 2 to 8 weeks：Anatomic exam showed the injected lumbar disc texture gradually stiffened，the lumbar disc protruded into the spinal canal，and the spinal nerve roots bonded，difficult to be separated.There was osteophyte formed around the periphery of the disc.X-ray showed that the lumbar gap gradually narrowed，formed the osteophyte，and the foramen waned.Histology showed the annulus gradually became thinner，and part of the regional fiber layers arranged scattered，the Nucleus vanish and have been taken place by osteoid tissue and bone.ConclusionThe lumbar disc degeneration model can be established by 0.9% injecting saline into lumbar disc of rabbit.

intervertebral discs cataplasia；animal model；0.9% saline；rabbit

1008-5572(2014)05-0427-03

湖南省自然基金資助項目(06JJ4109)；湖南省科技廳科技計劃資助項目(2009SK3080)；*本文通訊作者：陳鐵柱

R681.5+3

：A

2013-12-16

李曉聲(1957- )，男，主任醫師，湖南省人民醫院，410005。