17β-雌二醇對小鼠肺成纖維細胞細胞周期的影響*

王 悅，計阿丹，肖永紅

河北聯(lián)合大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室 唐山 063000

矽肺是我國目前常見且危害性嚴重的一種職業(yè)病，臨床表現(xiàn)主要為肺部彌漫性纖維化。肺纖維化最顯著的特點是細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)大量合成，降解受到抑制，造成富含膠原的ECM大量沉積，形成纖維化。現(xiàn)有研究[1]表明小凹蛋白(caveolin-1)是細胞膜上信號分子富集區(qū)-質(zhì)膜囊泡結(jié)構(gòu)的主要功能性結(jié)構(gòu)蛋白，它穿梭于胞質(zhì)與胞膜之間，結(jié)合胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，負性調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)，從而抑制膠原的沉積以及肺纖維化的發(fā)展。17β-雌二醇(17β-estradiol，17β-E2)可以誘導(dǎo)小凹蛋白的表達，提示17β-E2可能參與了肺纖維化的過程[2]。作者觀察了17β-E2對小鼠肺成纖維細胞細胞增殖和細胞周期的影響，以期為肺纖維化的治療提供新的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠肺成纖維細胞株L929細胞(上海博谷生物公司)于液氮中存儲。將17β-E2(北京博奧森生物公司)溶解于二甲基亞砜(DMSO)，制成濃度為10－2mol/L的母液，然后用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成濃度為 10－6、10－7、10－8mol/L 的藥液，4℃儲存?zhèn)溆谩⒂坞xSiO2顆粒(95%以上的顆粒直徑＜5 μm，購于中國預(yù)防科學(xué)院勞衛(wèi)所)充分研磨后于180℃干烤6 h，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液配成SiO2質(zhì)量濃度為20、50、100 mg/L的溶液，4℃儲存。胎牛血清(杭州四季青公司)56℃水浴30 min滅活，4℃存儲備用。PBS緩沖液(北京四正柏生物公司)、DMSO(美國Sigma公司)常溫存放。四甲基偶氮唑鹽(MTT，購于美國Sigma公司)粉劑經(jīng)無菌PBS配置成濃度為5 mg/L的溶液，－20℃存儲備用。碘化丙啶(PI)熒光染料(杭州聯(lián)科生物公司)，4℃儲存;RNA酶(杭州聯(lián)科生物公司)，－20℃存放。EPICS?ALTRATM型流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)，318MC型酶聯(lián)免疫檢測儀(上海精科公司)。

1.2 L929細胞的培養(yǎng) 利用無菌超凈臺配制含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)液。快速取出液氮中保存的小鼠肺成纖維細胞于37℃水浴箱復(fù)蘇，接種于完全培養(yǎng)液中，于37℃、含體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液，以防止殘留的DMSO影響細胞的正常生長。

1.3 17β-E2對SiO2誘導(dǎo)的L929細胞增殖影響的觀察 采用 L9(33)正交實驗[3]，分析不同濃度SiO2、17β-E2及其干預(yù)時間3個因素對L929細胞增殖的影響。實驗因素及水平設(shè)定見表1。實驗共分為9組，每組設(shè)6個復(fù)孔。倒置顯微鏡下見細胞貼壁、形態(tài)良好并呈單層致密狀時，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化，制成密度為1×106mL－1的細胞懸液，按每孔200 μL接種在96孔板上，置于37℃、含體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞覆蓋面積達培養(yǎng)瓶80%左右時加入無血清RPMI 1640培養(yǎng)液同步化24 h。每組先加入相應(yīng)劑量的SiO2誘導(dǎo)24 h，然后加入相應(yīng)濃度17β-E2作用相應(yīng)的時間，最后使用MTT法測定細胞增殖率。酶聯(lián)免疫檢測儀測定波長為490 nm。根據(jù)實驗結(jié)果，篩選出細胞增殖抑制效果較明顯(吸光度值較低)的實驗條件用于后續(xù)實驗。

表1 SiO2和17β-E2對 L929細胞增殖影響的正交實驗設(shè)計表

1.4 17β-E2對SiO2誘導(dǎo)的L929細胞周期分布影響的觀察 實驗分成3組:空白對照組，SiO2誘導(dǎo)組，17β-E2干預(yù)組。選取對數(shù)生長期的L929細胞，胰酶消化，配制成細胞懸液，按1×106mL－1的密度接種于培養(yǎng)瓶中，于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁且呈單層致密狀，用無血清培養(yǎng)基同步化24 h，再分組處理。空白對照組常規(guī)培養(yǎng);SiO2誘導(dǎo)組應(yīng)用實驗用濃度的SiO2誘導(dǎo)細胞24 h;17β-E2干預(yù)組細胞經(jīng)SiO2誘導(dǎo)24 h后，用實驗用劑量的17β-E2干預(yù)相應(yīng)時間。處理完成后，3組細胞經(jīng)2.5 g/L胰酶消化，收集并高速離心5 min，去除培養(yǎng)液，用PBS沖洗1次，加入體積分數(shù)70%的冰乙醇4℃固定過夜。第2天離心去除固定液并重新用PBS懸浮細胞5 min，再次離心棄PBS后加入 400 μL PBS、40 μL PI和 2 μL RNA 酶室溫避光孵育10 min，然后上流式細胞儀檢測細胞周期。重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用正交實驗篩選出最佳實驗條件;3組細胞周期分布的比較采用單因素方差分析和LSD-t法檢驗，檢驗水準 α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖實驗結(jié)果 細胞增殖率測定、分析結(jié)果見表2、3。從表2、3可以看出，最佳實驗條件篩選結(jié)果為:應(yīng)用20 mg/L SiO2誘導(dǎo)，用10－6mol/L的17β-E2干預(yù)24 h。

2.2 細胞周期測定結(jié)果 見表4。可以看出，SiO2誘導(dǎo)組小鼠肺成纖維細胞G1期細胞比例較空白對照組降低，S+G2期細胞比例升高;而17β-E2干預(yù)組G1期細胞比例較SiO2誘導(dǎo)組升高，S+G2期細胞比例降低(P ＜0.05)。*:與空白對照組比較，P＜0.05;#:與SiO2誘導(dǎo)組比較，P＜0.05。

表2 SiO2和17β-E2對 L929細胞增殖影響的正交實驗及極差分析結(jié)果

表3 單因素方差分析結(jié)果

表4 各組L929細胞周期測定結(jié)果 %

3 討論

肺成纖維細胞是肺纖維化過程中的重要細胞，它們具有合成膠原蛋白和纖維的能力[4]。肺成纖維細胞在受到游離SiO2誘導(dǎo)下過度增生，就會大量分泌膠原蛋白，進而引起ECM大量合成和過度沉積，最終導(dǎo)致肺纖維化[5]。現(xiàn)有研究[6]表明女性肝硬化的發(fā)病率明顯低于男性，提示雌激素在纖維化過程中可能起保護作用，而17β-E2作為女性體內(nèi)活性最強的雌激素，可能具有抗纖維化的作用。17β-E2可增加小鼠肺成纖維細胞內(nèi)小凹蛋白的表達，而小凹蛋白又能抑制信號分子的活化，如MEK、ERK、JNK、PI3K 和 Akt等，進而抑制膠原合成[7]。有研究[8]表明17β-E2對細胞增殖具有雙重效應(yīng):低濃度17β-E2通過影響Cyclin D1的表達，促使細胞由G1期轉(zhuǎn)換到S期;高濃度17β-E2則通過影響B(tài)ax蛋白的表達選擇性誘導(dǎo)G2/M期細胞的凋亡。周期分布可直接反映細胞的增殖情況。

該研究利用L9(33)正交實驗觀察17β-E2對SiO2誘導(dǎo)的L929細胞增殖的影響，篩選出20 mg/L SiO2誘導(dǎo)24 h，然后用10－6mol/L 17β-E2 干預(yù)24 h的實驗條件。然后，在該實驗條件下，作者觀察了L929細胞周期分布的變化。結(jié)果顯示，SiO2誘導(dǎo)組小鼠肺成纖維細胞G1期細胞比例較空白對照組降低，S+G2期細胞比例升高;而17β-E2干預(yù)組G1期細胞比例較SiO2誘導(dǎo)組升高，S+G2期細胞比例降低。上述結(jié)果提示17β-E2可以提高肺成纖維細胞細胞周期中G1期細胞的比例，減少S期和G2期細胞的比例，有效阻抑細胞由G1期進入G2和S期，從而抑制小鼠肺成纖維細胞的增殖。

[1]張勤勤，孫潤廣，李連啟.Caveolae及其蛋白家族的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和功能的研究現(xiàn)狀[J].北京生物醫(yī)學(xué)工程，2011，30(2):215

[2]Liu HM，Zhao XF，Guo LN，et al.Effects of caveolin-1 on the 17 beta-estradiol-mediated inhibition of VSMC proliferation induced by vascular injury[J].Life Sci，2007，80(8):800

[3]鄧振偉，于萍，陳玲.SPSS軟件在正交試驗設(shè)計、結(jié)果分析中的應(yīng)用[J].電腦學(xué)習(xí)，2009(5):15

[4]鮑榮輝，劉先哲，周軍.人成纖維細胞的原代培養(yǎng)及鑒定[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，28(5):577

[5]朱蘭，馮莉，伊雪，等.SiO2對肺泡巨噬細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1和肺成纖維細胞Ⅲ型膠原表達的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，38(14):2797

[6]劉清華，董國芳，盛穎，等.生理劑量的雌激素對雌、雄性大鼠肝纖維化形成的影響[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2010，19(1):14

[7]王林金，陳茂偉.Caveolin-1蛋白對肝細胞癌ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，29(2):210

[8]Ali WW，李世文，羅儀，等.不同濃度雌激素對大鼠膀胱平滑肌細胞的增殖與凋亡的影響[J].武漢大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2008，29(6):712