CK18在胃癌及區域轉移淋巴結中的表達及意義

柴軍輝，張占東，馬 奇，花亞偉

(1.鄭州大學第一附屬醫院 胃腸外科 河南 鄭州 450052;2.河南省腫瘤醫院 普外科 河南 鄭州450003)

隨著社會的發展及人們生活方式的改變，胃癌的發病率較以往明顯增長，我國胃癌患病及死亡率均超出世界平均水平的兩倍，約每3 min就有1名中國人死于胃癌［1］，與此同時，胃癌的治療水平也在不斷改進，目前我國治療胃癌的主要方案包括根治性手術、放療化療、介入治療、生物治療以及中西醫結合等一系列抗腫瘤措施。胃癌患者術后的復發率和轉移率與TNM分期密切相關，準確地判斷分期是胃癌患者預后的重要依據。另外，術后系統的輔助治療也能夠有效地降低復發率與轉移率。

角蛋白CK是單層上皮細胞內重要的細胞骨架成分，作為中間纖維絲蛋白家族主要成員，CK廣泛存在于上皮組織及許多上皮組織來源的腫瘤中，其表達取決于上皮組織的類型和細胞分化程度，且與腫瘤的多種特性如浸潤、轉移及藥物敏感性的改變相關，CK在上皮來源腫瘤組織中持續穩定表達，使抗CK抗體在檢測鑒定中得以廣泛應用［2-3］;CK18屬于低分子量蛋白，與其他角蛋白成分不同之處在于CK18上皮分布的特異性更加典型，尤其是在腺上皮來源的細胞內［4］，因此可用于腺癌的特異性診斷。本研究旨在探索CK18的陽性表達與胃癌及周圍淋巴結微轉移之間的密切關系，為尋找胃癌轉移的關鍵分子，確定患者預后的高危因素及臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料:標本均取自河南省腫瘤醫院普外科2012年至2013年行胃癌手術切除的150例病例，術前行CT檢查均提示肝胃間多發淋巴結，所有患者術前均未進行任何抗腫瘤治療。其中男性86例，女性64例，年齡40～70歲，平均年齡(59.3±4.0)歲。150例胃癌患者均行D2根治術，其中有118例伴有淋巴結轉移(清掃淋巴結平均15個/例)，32例不伴有淋巴結轉移。離體標本手術切除后立即置于液氮中(不超過2 h)，之后轉移至－80℃低溫冰箱保存。在做病理診斷時，每個病例取樣本中心部位的癌組織以及鄰近淋巴結8～15個。

1.1.2 主要儀器設備、試劑:LEICA SM2010R切片機(上海萊卡儀器有限公司)，光學顯微鏡(日本OLYMPUS)，101型電熱干燥箱(北京市永光明醫療儀器廠)，原位雜交儀 ThermoBriteTM(StatSpin，USA)，全自動多功能組織病理檢測系統Ventana Bench Mark XT，配套試劑盒Ultra View Universal DAB Detection Kit(包含 Ultra View Universal DAB inhibitor、Ultra View Universal DAB Chtomogen、Ultra View Universal HRP Multimer、Ultra View Universal DAB H2O2、Ultra View Universal DAB Copper)，4℃冰箱保存;一抗:Anti-Her-2/neu(4B5)購自德國羅氏診斷有限公司;人細胞角蛋白18試劑盒(Human cytokeratin 18，CK-18 ELISA KIT)，購自上海勁馬實驗設備有限公司。

1.1.3 試劑有效性驗證:核對所有試劑的貨號、有效期、克隆號等相關數據并記錄;用已知的陽性對照組織測試所有的試劑;由專門負責質量控制的醫生評價檢測抗體的有效性。

1.2 檢測方法 選取不同類型的胃癌組織，伴或不伴淋巴結轉移，分別進行免疫組化染色。以CK18表達陽性或陰性為依據分組，具體步驟如下:①將制備好的組織芯片石蠟切片經二甲苯脫蠟兩次后水化。②PBS洗片3×3 min。③將組織芯片切片進行抗原修復。④加入3%過氧化物酶阻斷劑，37℃ 15 min。⑤PBS洗片3×3 min。⑥加入封閉液，37℃ 10 min。⑦分別滴加一抗，置于濕盒中4℃過夜。⑧滴加生物素標記的二抗，37℃15 min。⑨滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，37℃ 15 min。⑩滴加DAB顯色，經蘇木素復染、返藍、脫水、透明，封片，顯微鏡觀察、照相。

1.3 判定標準 免疫組化陽性表達的定性判斷，著色區表現為淡黃色細顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆粒，對應弱(+)、中(++)、強(+++)3 級。

1.4 統計學處理 所有數據使用SPSS 16.0軟件進行統計學處理，率的比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CK18表達與患者年齡性別的相關性 在胃癌組織伴或不伴有癌轉移的淋巴結中，CK18的表達率與患者的性別和年齡無關，差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

2.2 CK18表達與胃癌組織學類型以及淋巴結轉移的相關性 胃癌原發組織中CK18的陽性表達與組織類型無關(χ2=1.44，P ＞0.05)，淋巴結轉移與胃癌組織類型無關(χ2=3.94，P ＞0.05)，CK18 在轉移淋巴結中的陽性表達與胃癌組織類型無關(χ2=0.88，P＞0.05)。見表 2、表3。

表1 CK18表達與患者年齡性別的相關性分析(n)

表2 CK18表達與組織學類型的相關性分析(n，%)

表3 淋巴結轉移及淋巴結中CK18的表達與不同組織學類型的相關性分析(n)

2.3 CK18表達與胃癌淋巴結轉移的相關性 癌轉移的淋巴結組織中CK18陽性表達率要高于無癌轉移的淋巴結，差異有統計學意義(χ2=14.92，P ＜0.01)，見表4。

表4 CK18表達與胃癌淋巴結轉移的相關性分析(n，%)

2.4 CK18表達與胃癌淋巴結轉移個數的相關性根據2010年美國癌癥聯合委員會(AJCC)胃癌TNM分期指南，依據區域淋巴結轉移的個數分為N0(0個)、N1(1～2個)、N2(3～6個)、N3(7個及以上)。所選病例中未發現N3病例。結果中N1與N2進行比較，差異有統計學意義(χ2=9.75，P ＜0.01)，即在胃癌伴有淋巴結轉移的患者中，CK18的表達率與淋巴結轉移的個數相關，見表5。

表5 CK18表達與胃癌淋巴結轉移個數的相關性(n，%)

3 討論

腫瘤轉移按照目前學術界公認的分類應包括4種:病理HE染色認定的病灶≥2 mm，稱為轉移(metastasis，M);0.2 mm＜ 病灶 ＜2 mm的稱為微轉移(micrometastasis，MM);病灶≤0.2 mm 的稱為亞顯微轉移［5-6］;單個淋巴結僅有1個轉移癌細胞則被稱為冬眠癌細胞;而微轉移腫瘤細胞和孤立冬眠腫瘤細胞往往是癌癥患者復發或遠處轉移的潛在因素［7-8］。常規病理檢查與診斷對癌轉移不夠靈敏，小于0.2 mm的癌轉移灶不容易被發現，而且微小的轉移灶，甚至孤立的冬眠腫瘤細胞很可能在切片過程中被漏掉。研究證明，對胃癌周圍淋巴結行免疫組化檢測，會有近50%的較小癌轉移灶被漏診［9］。因此根據常規病理結果，患者術后的病理分期常常存在相對誤差，從而導致術后的其他輔助治療不夠完善。

研究發現CK18在胃癌原發灶及轉移淋巴結中均有較高水平的表達。本研究150例病理檢查報告中，118例淋巴結轉移的患者中，N1期CK18陽性表達率為78.85%，N2期的表達率為96.97%;兩者之間差異有統計學意義(P＜0.05);另外CK18的表達與淋巴結轉移的個數存在相關性，即轉移淋巴結越多，在腫瘤浸潤程度相同的情況下，腫瘤的TNM分期越晚，CK18的表達水平也越高。

在分子水平上，CK18分子量較小，是一種中間絲蛋白，為細胞蛋白骨架的一部分，是上皮性腫瘤較特異的免疫組化標志，陽性顆粒主要位于細胞漿，在惡性轉化和腫瘤發生過程中，它持續存在于上皮細胞腫瘤內，而在正常淋巴結的細胞、外周血以及骨髓等造血細胞中，CK18的表達是微乎其微的;另外在胃癌中CK18的mRNA呈高表達，而在正常外周血和正常淋巴結中不表達［10］。因此，在臨床病理檢驗中，檢測淋巴結組織中CK18的表達，可協助診斷淋巴結是否發生轉移。近年來針對CK18的研究日漸增多，血清中CK18的表達常伴隨腫瘤遠處的轉移［11-12］，研究證實，在外周血及骨髓中如果檢測到CK的表達，則認為可能已經發生腫瘤遠處的轉移。

另外，自20世紀30年代“瓦伯格效應”(腫瘤和正常成體組織存在代謝差異，它們通過糖酵解產能，并生成大量的副產品—乳酸)的提出，針對腫瘤細胞的代謝，國內外進行了大量的研究，據美國紐約冷泉港實驗室(CSHL)稱腫瘤細胞的糖酵解途徑加強，其中丙酮酸激酶2的蛋白促進了這一代謝過程，對腫瘤的形成及生長起著至關重要的作用，CK18的表達參與了構成腫瘤細胞代謝所需的微環境，這種微環境能夠激活單羧基轉運體MCT1和MCT4以及細胞內普遍存在的Na+-H+交換器［13］，使腫瘤細胞糖酵解相關酶類不致失活，而且這種環境使得糖酵解關鍵酶-丙酮酸脫氫酶激酶的表達量增多，從而保證腫瘤細胞的正常代謝。由此可見，CK18在腫瘤轉移的代謝過程中發揮重要的作用。

最近Oyama研究小組對胃癌患者血清中的CK18進行了跟蹤，其中隨訪時間平均為26.5個月(4.5～40.5 個月)，總生存期平均為 20.4 個月(1.4 ～40.5個月)，發現如果患者血清中的CK18水平越高，其生存時間就越短［11］。在今后的研究中我們將繼續對胃癌術后患者進行定期隨訪，評估組織樣本中CK18表達水平同患者術后生存期的相關性，進一步揭示CK18動態變化與胃癌發生、發展和轉移的關系，探討對胃癌療效觀察和預后評估的臨床應用價值。綜上所述，檢測腫瘤組織以及淋巴結組織內CK18陽性表達率將有助于我們重新認識腫瘤的預后情況，CK18可作為一種用來描述腫瘤患者預后情況的新指標。

［1］柯彬，劉寧，梁寒，等.138例淋巴結轉移陰性胃癌患者的預后因素分析［J］.中華胃腸外科雜志，2011，14(3):192-195.

［2］許良中.實用腫瘤病理方法學［M］.上海:上海醫科大學出版社，1997:237-238.

［3］Ishida K，Katsuyama T，Sugiyama A，et al.Immunohistochemical evaluation of lymph node micrometastases from gastric carcinomas［J］.Cancer，1997，79(6):1069-1076.

［4］陳一丁，劉福坤，祁曉平，等.胃癌骨髓微轉移細胞數量與增殖性的研究［J］.醫學研究生學報，2001，14(4):297-298.

［5］陳錫美，陳國裕，張霞.胃癌患者外周血微轉移的細胞學檢測［J］.中華消化雜志，2002，22(8):481-484.

［6］單洪麗，續薇，所健，等.實時熒光定量PCR檢測CK18對胃癌淋巴結微轉移的診斷價值［J］.中國腫瘤，2009，18(4):325-328.

［7］湯釗猷.現代腫瘤學［M］.第2版.上海:上海醫科大學出版社，2000:775-818.

［8］翟瑜，李勇，蘇力，等.胃癌組織及區域淋巴結微轉移與胃癌生物學標志基因的臨床關系［J］.中國老年學雜志，2009，11(29):2859-2862.

［9］Taniyama K，Motoshita J，Sakane J，et al.Combination analysis of a whole lymph node by one-step nucleic acid amplification and histology for intraoperativedetection of micrometastasis［J］. Pathobiology，2006，73(4):183-191.

［10］張德.CK6和CKl8mRNA的表達與胃癌患者淋巴結微轉移的關聯［J］.臨床輸血與檢驗，2011，13(2):164-167.

［11］Oyama K，Fushida S，Kinoshita J，et al.Serum cytokeratin 18 as a biomarker for gastric cancer［J］.Clin Exp Med，2013，13(4):289-295.

［12］裴鋒，朱毅.細胞角蛋白18片段檢測在胃癌診斷中的臨床意義［J］.腫瘤防治研究，2012，39(4):439-441.

［13］吳國豪.腫瘤治療新策略:針對腫瘤細胞代謝特征的靶向治療［J］.中國實用外科雜志，2009，1(29):23-25.