不同劑量環孢菌素A制備免疫缺陷小鼠模型的研究

張予晉 ，李 玲 ，楊勝輝 ，高 強 ，向 琴 ，婁 芳 ，王澤亮 ，鄭 萌 ，歐小香 ，王軍文 *

（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

不同劑量環孢菌素A制備免疫缺陷小鼠模型的研究

張予晉1，李 玲2，楊勝輝2，高 強2，向 琴2，婁 芳2，王澤亮2，鄭 萌2，歐小香2，王軍文2*

（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

目的研究不同劑量環孢菌素A（CsA）對小鼠免疫功能的影響，為細胞免疫缺陷型動物模型的建立奠定基礎。方法實驗設CsA高、中、低劑量組，溶液對照組和正常對照組。CsA高、中、低劑量組分別經腹腔注射CsA 40、25、10 mg/（kg·d），溶液對照組給予等容積的稀釋液，正常對照組給予等容積生理鹽水，隔天1次，共注射3次。觀察以下指標：（1）CD4+T和CD8+T細胞亞群百分率；（2）小鼠脾臟、胸腺質量指數和病理變化；（3）小鼠肺組織的病理變化及小鼠死亡率。結果與正常對照組和溶液對照組比較：（1）高、中劑量CsA組CD4+T細胞亞群百分率明顯下降 （P<0.05或P<0.01），高劑量組 CD8+T細胞亞群百分率明顯升高（P<0.05）；（2）CsA高、中劑量組胸腺指數明顯下降（P<0.01），胸腺萎縮、脂肪變性、中間有淋巴小結樣結構，脾臟指數各組間前后均無明顯改變；高、中、低劑量組脾臟均有代償性的白髓增大、脾小體增大、巨噬細胞增多；（3）高、中、低劑量CsA肺臟有局灶性炎癥改變、間質增生、肺泡纖維度增生；高劑量組的小鼠死亡率顯著升高，達60%。結論腹腔注射高、中劑量的CsA均可成功建立免疫缺陷型動物模型，但從效率和經濟性考慮，中劑量CsA更適合用于模型的建立。

CsA；免疫缺陷；動物模型

艾滋病 (Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)是由人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）感染引起的獲得性免疫缺陷綜合征。其發病機制為艾滋病病毒破壞機體的免疫系統，尤其是破壞輔助性T淋巴細胞，導致CD4+T細胞進行性減少，細胞的免疫功能受損，并且逐漸發展一系列機會性感染及腫瘤，嚴重者可導致死亡[1]。由于目前尚無有效的治愈方法，AIDS已成為人類致死性傳染病之一。通過中醫藥或者中西醫結合的方法進行免疫重建，提高患者的生存質量、延長生存時間已經成為其防治重要的研究方向[2]，而成功建立符合AIDS致病機制的免疫缺陷動物模型則是研究基礎[3]。目前符合AIDS免疫缺陷的動物模型有很多種，但往往免疫缺陷機制和AIDS發病機制相差較大且死亡率過高，課題組為了尋找更加適合中醫藥AIDS免疫重建研究的免疫缺陷模型，在前期實驗的基礎上，以環孢菌素A(Cyclos-porin A，CsA)為造模藥物，以小鼠為造模動物，分為高、中、低劑量組分別造模進行篩選合適劑量，成功造出符合AIDS發病機制的免疫缺陷動物模型，并找出性價比較高的造模劑量，以期為后續實驗提供可靠模型，現報道如下。

1 材料

1.1 實驗動物

昆明系小鼠，雄性，體質量20～24 g，6～8周齡，SPF級，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK（湘）2011-0003。

1.2 試劑

CsA由鼎國生物技術有限公司提供，產品批號K0077，規格：250 mg，4 ℃冰箱保存，用時以35%注射用乙醇稀釋液稀釋。Rat Anti-Mouse CD4+T FITC標記抗體 (批號：2013-12)和Rat Anti-Mouse CD8 PE標記抗體（批號：2014-07）由北京四正柏生物科技有限公司提供，4℃冰箱保存。免洗溶血素（批號：3074768）由美國BD公司提供。

1.3 主要儀器

BD FACSCcalibur TM流式細胞儀，由美國Becton-Dickinson公司提供；OLYMPUS BX43顯微鏡。

2 方法

2.1 模型制備

取小鼠 50 只， 隨機分為高 40 mg/（kg·d）、中25 mg/（kg·d）、低劑量 10 mg/（kg·d）CsA 組、溶液組及正常對照組5組，每組10只。高、中、低劑量CsA組分別經腹腔注射給予CsA；溶液組給予相應稀釋液；正常對照組給予相應生理鹽水，隔天1次，共注射3次。末次注射后第2天，處死小鼠檢測相應指標并評價效果。

2.2 指標檢測

2.2.1 外周血T細胞亞群的檢測 小鼠稱質量、麻醉后打開胸腔，采用心臟采血法采血，用1 mL注射器在心尖搏動處抽取0.5 mL血液，立即放入EDTA抗凝管中，并充分混勻，取100 μL抗凝血加入10 μL CD4+T(FITC-A)單抗和 10 μL CD8（PE-A）單抗，充分混勻，室溫下避光孵育20 min，加入500 μL免洗溶血素并充分混勻，室溫下避光孵育20 min，上流式細胞儀進行分析。

2.2.2 脾臟、胸腺質量指數與病理變化 采血后處死小鼠分離胸腺和脾臟，用濾紙吸取表面殘血，電子天平稱質量，并計算器官質量指數。（器官質量指數=器官質量×1000/體質量）解剖取胸腺、脾臟、肺臟，用l0%甲醛固定、HE染色后光學顯微鏡下觀察病理改變。

2.2.3 肺組織病理變化與小鼠死亡率 分離小鼠肺臟，用l0%甲醛固定、HE染色后光學顯微鏡下觀察病理改變；實驗全程觀察小鼠死亡情況，計算死亡率。

2.3 統計學分析

3 結果

3.1 不同劑量CsA對小鼠外周血T細胞亞群百分率的影響

與正常對照組和溶液對照組比較，CsA高、中劑量組CD4+T細胞亞群百分率明顯下降，差異顯著（P<0.05或P<0.01）；高劑量組CD8+T細胞亞群百分率明顯上升，差異顯著（P<0.05）；高、中劑量組CD4+/CD8+T細胞明顯下降，差異顯著 （P<0.01）。結果表明：不同劑量CsA不同程度下調小鼠外周血CD4+T細胞亞群百分率和CD4+/CD8+T細胞，其中以中、高劑量組最為明顯。結果見表1。

表1 不同劑量CsA對小鼠外周血T細胞亞群的影響 （±s）

表1 不同劑量CsA對小鼠外周血T細胞亞群的影響 （±s）

注：與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與溶液對照組比較#P<0.05，##P<0.01。 下表同。

組 別正常對照組溶液對照組CsA高劑量組CsA中劑量組CsA低劑量組例數（只）10 10 4 9 9 CD4+T細胞g（%）42.15±16.60 33.40±11.40 10.95±13.49*#12.03±15.72**#34.08±2.36 CD8+T細胞g（%）12.15±5.50 9.78±2.01 18.30±6.93*#9.03±3.43 10.65±1.86 CD4+T/CD8+T 3.53±0.84 3.41±0.92 0.82±1.05**##1.26±1.33**##3.26±0.52

3.2 不同劑量CsA對小鼠脾臟、胸腺質量指數的影響

與正常對照組比較，CsA高、中、低劑量組胸腺指數明顯下降（P<0.01或P<0.05）；與溶液對照組比較，高中劑量組胸腺指數明顯下降 （P<0.01或P<0.05）。表明：不同劑量CsA對小鼠免疫器官質量指數均有一定的抑制作用，以中、高劑量組最為明顯。結果見表2。

表2不同劑量CsA對小鼠脾臟、胸腺質量指數的影響 （±s）

表2不同劑量CsA對小鼠脾臟、胸腺質量指數的影響 （±s）

組 別正常對照組溶液對照組CsA高劑量組CsA中劑量組CsA低劑量組例數（只）10 10 4 9 9胸腺指數2.46±0.94 2.09±0.19 1.08±0.20**##1.29±0.31**#1.64±0.40*脾臟指數4.52±0.85 4.42±0.75 4.41±0.43 4.34±0.60 4.78±1.00

3.3 不同劑量CsA對小鼠脾臟、胸腺病理變化的影響

由圖1、圖2可知：正常對照組和溶液對照組胸腺及脾臟無明顯病理損傷，與正常對照組和溶液對照組比較，CsA高劑量組和中劑量組有明顯胸腺萎縮、脂肪變性，中間可見淋巴小結樣結構，低劑量組也可見胸腺萎縮。CsA高、中、低劑量組脾臟均有代償性的白髓增大，脾小體增大，巨噬細胞增多。結果表明：不同劑量CsA對小鼠免疫器官脾臟和胸腺組織均有不同程度的損傷，嚴重破壞了小鼠免疫系統，影響其免疫調節功能。結果如圖1、圖2所示，見封三彩圖。

3.4 不同劑量CsA對小鼠肺組織病理變化與小鼠死亡率的影響

由圖3可知：正常對照組和溶液對照組肺臟無明顯病理損傷，與正常對照組和溶液對照組比較，CsA高、中、低劑量組小鼠肺臟有局灶性炎癥改變、間質增生、肺泡纖維度增生。結果表明：肺臟肺組織病理變化的改變可能與小鼠免疫功能低下，容易受到肺部感染有關。結果如圖3所示，見封三彩圖。

不同劑量環保菌素A對小鼠的死亡率有明顯影響，低、中劑量組小鼠分別死亡1只，死亡率10%，但高劑量組小鼠死亡6只，死亡率達60%，不利于動物模型的建立。

圖1 各組小鼠胸腺的病理變化光鏡圖(HE×40)

圖2 各組小鼠脾臟組織的病理變化光鏡圖(HE×40)

圖3 各組小鼠肺臟組織的病理變化光鏡圖(HE×40)

4 討論

CsA是從真菌中提取的一種免疫抑制劑，臨床上常應用于器官移植后排斥反應和自身免疫性疾病的防治[4-5]。CsA對細胞免疫和胸腺依賴性抗原的體液免疫有較強的選擇性抑制作用，主要選擇性抑制T淋巴細胞，尤其對Th細胞產生白細胞介素-2等各種因子有明顯的抑制作用，而對巨噬細胞以及B淋巴細胞的抑制作用較弱[6]。此外，CsA還可能直接影響T細胞表面結構和識別功能，阻止T細胞活化[7]，是用于細胞免疫缺陷型動物模型的建立理想制劑[4]。

AIDS的發病機制是HIV選擇性破壞輔助性T淋巴細胞，導致CD4+T細胞進行性減少，CD8+T細胞進行性上升，細胞的的免疫功能受損。T淋巴細胞是機體免疫系統內功能最重要的一群淋巴細胞，主要CD4+T細胞/CD8+T細胞亞群組成，因此，CD4+T細胞/CD8+T細胞百分率以及CD4+T細胞/CD8+T細胞比值可以作為衡量免疫缺陷程度的重要指標[8]，更是模型免疫缺陷是否符合AIDS發病機制的重要指標。胸腺和脾臟是重要的免疫器官，胸腺的主要功能是產生T淋巴細胞和分泌胸腺素，主要參與細胞免疫；脾臟中有豐富的淋巴細胞和巨噬細胞，但B淋巴細胞比例較大，因此與體液免疫關系更為密切。

本研究結果顯示：高、中、低劑量的CsA對小鼠免疫功能均有一定的抑制作用，其中以高、中劑量對小鼠免疫功能的影響最為明顯。與正常對照組和溶液對照組比較，高、中劑量組CD4+T細胞百分率、胸腺指數明顯下降（P<0.05或P<0.01），并伴有明顯的胸腺及脾臟病理變化。由于艾滋病的發病機制是HIV選擇性破壞輔助性T淋巴細胞，導致CD4+T細胞進行性減少，細胞的免疫功能受損。因此，我們認為：高、中劑量的CsA所建立的的免疫缺陷動物模型與AIDS CD4+T減少主要病理特征相吻合。但高劑量組死亡率明顯高于中劑量組，從模型建立的穩定性、效率以及經濟上考慮，中劑量組更適合于AIDS免疫缺陷型動物模型的建立。

[1]張學軍.皮膚性病學[M].北京：人民衛生出版社，2011：236.

[2]劉 震，劉 明，李 勇，等.艾滋病免疫重建干預方法的研究進展[J].中國中藥雜志，2013,38（15）：2 519-2 525.

[3]楊傳波，徐興然，蔡家利.人類艾滋病動物模型研究進展[J].動物醫學進展，2005，26（3）：46-50.

[4]杜美蓉，李大金.環孢酶素A的臨床應用機制研究進展[J].中國臨床藥理學雜志，2003，19（6）：454-457.

[5]Yings Khan LN，Weng Q，et a1．Cyclosporin A，apoptosiaof BAL T-cells and expression of Bcl-2 in asthmatics[J]．Eur Respir J，2003，22(2)：207-212．

[6]王麗華．環孢素A藥物作用及機制與臨床應用[J]．中外健康文摘，2013(39)：41．

[7]王 維，臻銀燕，陳 耀．環孢菌素A的作用機制及臨床應用[J]．海峽藥學，2007，19(10)：103-105．

[8]覃紹堅．艾滋病的T淋巴細胞免疫學的研究進展[J]．右江民族醫學院學報，2007，29(1)：98-100．

（本文編輯 楊 瑛）

Study on Different Doses of Cyclosporin A for Preparing Immunodeficiency Mice Models

ZHANG Yujin1,LI Ling2,YANG Shenghui2,GAO Qiang2,XIANG Qin2,LOU Fang2,WANG Zeliang2,ZHENG Meng2,OU Xiaoxiang2,WANG Junwen2*
(1.The Second Affliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China；2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo study different doses of cyclosporin A(CSA)on the effect of immune function in mice and to lay the foundation for cellular immune deficient animal model.MethodsThe experiment is divided into high dose group,middle dose group,and low dose group,which were intraperitoneal injected with CSA:40 mg/(kg·d),25 mg/(kg·d)and 10 mg/(kg·d),respectively.Wealsosetsolution controlgroup which weregiven the samedose of diluent,and normal control group which were given equal saline,injecting one times every other day for total three times.The following indicators were observed:（1） The percentage of CD4+T and CD8+T lymphocyte subsets; （2） The weight index and pathological changes of the spleen and thymus; （3）Pathological changes of the lung and mortality rate in mice.ResultsCompared with normal control group and solution control: （1） high and middle dose group of the percentage of CD4+T cells decreased apparently(P<0.05/P<0.01).The percentage of CD8+T cells increased significantly only in the high dose group(P<0.05). （2） High and middle dose group of the weight index of thymusdecreased apparently (P<0.05),thymusatrophy associated with fatty degeneration,lymphoid nodule sample structure in the middle;spleen white medullary and splenic corpuscle in the high,middle and low dose group enlarged and macrophages increased; （3） The lungs in the high,middle and low dose groups had focal inflammation,pulmonary interstitial hyperplasia and alveolar fiber hyperplasia;The mortality in high dose group of significantly increased(P<0.05).ConclusionThe immune deficiency mice models could be successfully established by intraperitoneal injection of high or middle dose CSA.While considering from efficiency and economy,middle dose CSA is more suitable for building models.

cyclosporine A;immunodeficiency;animal models

R965.1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.11.004.014.04

2014－05－08

湖南省科技廳資助項目(2013SK3097)；湖南省高校科技創新團隊《感染性疾病中醫藥防治研究》資助項目（No.15）；湖南中醫藥大學重點學科《基礎醫學》、《病原生物學》資助項目（No.1）；湖南省中醫藥科研項目(201470)。

張予晉，男，醫師，主要從事中醫皮膚病治療臨床工作。

* 王軍文，男，教授，E-mail：wangjunwen_1963@126.com。

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