THBS4基因在高原地區胃癌組織中表達的生物學行為及臨床意義

祁永清 李菊英 賀菊香 張夢嵐

高原缺氧的惡劣環境，導致機體發生一系列機能和形態的變化，胃腸道對缺氧較為敏感，可引起胃黏膜出血、胃潰瘍等消化系統疾病。在高原低氧地區胃黏膜出血、胃潰瘍、慢性萎縮性胃炎比平原地區高發。胃癌是高原地區常見的惡性腫瘤之一，發病趨于年輕化，而且大部分患者來就診時就已進入了中晚期，失去了最佳的治療機會，是一種嚴重威脅高原地區人民生命健康的主要疾病。胃癌的發生是多因素參與的多階段、多步驟過程，導致細胞過度增生、異常分化、細胞凋亡減少而形成的。選擇特異性性抗體，對胃癌早期診斷及胃癌細胞生物學的影響和胃癌患者的預后評估有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2010年7月至2011年5月青海大學附屬醫院及青海省人民醫院送檢病理科的胃癌切除標本60例，男38例，女22例;年齡35～80歲，平均55.7歲;高分化10例，中分化21例，低分化29例;淋巴轉移33例，無轉移27例。取正常體檢并本人自愿情況下的正常胃黏膜2～4塊，共10例。年齡28～74歲，平均年齡(47±8)歲。上述標本，留取部分-80℃保存以備提取RNA，部分經10%中性甲醛固定48 h，常規脫水、透明和包埋，連續切片，厚度為4μm，HE常規染色診斷，符合實驗要求的組織蠟片置于預先涂有多聚賴氨酸的載玻片烤干備用。

1.2 試劑 THBS4一抗為兔抗人多克隆抗體，購自美國GENETEX公司。即用型第二抗體A、B液、檸檬酸抗原修復液、PBS工作液、濃縮型DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司。RT-PCR試劑:Trizol試劑(購自北京賽百盛公司)、RT-PCR試劑盒(購自美國Promega公司)、100bpDNA marker(購自上海生物工程公司)、PCR引物(購自上海生物工程公司)、瓊脂糖(購自上海GeneTech公司)、Tfis堿(購自美國Sigma公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化S-P法檢測THBS4蛋白的表達:石蠟切片(4μm)、37℃烤片過夜、二甲苯Ⅰ30 min，二甲苯Ⅱ脫蠟30 min、100%、95%、90%、85%、80%乙醇依次水化5 min、PBS洗3次×5 min、檸檬酸高壓抗原間接修復10 min、自來水中放置高壓鍋降溫，降至高壓鍋微溫時取出組織切片、滴加一抗(THBS4抗體稀釋度為1∶75、濕盒放置37℃溫箱2 h、PBS洗3次 ×5 min、滴加二抗(抗鼠/兔)，增強劑，濕盒放置37℃溫箱30 min、PBS洗3次×5 min、滴加二抗(抗鼠/兔)，穩定劑，濕盒放置37℃溫箱30 min、鮮配制DAB顯色，鏡下控制5～10 min、PBS漂洗，終止顯色、蘇木素復染45 s，1%鹽酸酒精分色，溫水沖洗反藍、75%、95%、100%乙醇脫水各5 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。組化染色中PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 RT-PCR檢測THBS4mRNA在胃癌中的表達:總RNA的提取:RIZOL試劑一步法總RNA提取，用紫外分光光度計測定總RNA的濃度。

1.3.3 cDNA的合成:用mRNA發轉錄成cDNA，各取5μg總 RNA，分別加入0.4μl oligodT，后加 DEPC-treated H2O至 20 μl，70℃，10 min變性，迅速插冰冷卻。各 加 入 5 × RT buffer 6 μl，dNTP 2 μl(2.5 mmol/L)，RNase抑制劑 0.5 μl(40 U/μl)，充分混勻。加入M-MLV逆轉錄酶各1μl，輕輕混勻，37℃孵育1 h，70℃ 15 min滅活，終止反應。

1.3.4 設計引物，序列為:THBS4:202 bp

每次PCR反應均設置no-template陰性對照，以1μl ddH2O代替模板，消除體系污染造成的假陽性。PCR反應在Biometra熱循環儀中進行。

1.4 反應條件 94℃預變性4 min。循環參數:94℃30 s;55℃ 45 s;72℃ 30 s。32 個循環后，72℃ 延伸10 min。

1.5 結果判定

1.5.1 免疫組化的結果判定:THBS4蛋白在細胞胞漿，及胞膜出現淡染的棕黃色顆粒;著色大于等于10%為陽性，小于10%為陰性。

1.5.2 THSB4的RT-PCR陽性表達結果判定:PCR產物行2.0%瓊脂糖凝膠(含0.25μg/ml EB)電泳。分別取樣品PCR產物6μl以80 V電壓電泳約30 min，凝膠成像系統觀察結果，照相記錄實驗結果。

1.6 統計學分析 應用SPSS17.0統計軟件，臨床病理指標與表達程度之間采用χ2檢驗，當n≥40但有1≤T＜5時，以及n＜40或T＜1時，四格表資料結果采用fisher確切概率法檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織中THBS4 mRNA的表達情況 胃癌組織中THBS4 mRNA表達陽性者39例(65.0%)，表達陰性者21例(35.0%)，在不同分化胃癌組織中呈現差異表達(圖1)。

圖1 RT-PCR檢測不同分化胃癌組織THBS4的差異表達

2.2 胃癌組織中THBS4 mRNA的差異表達與不同臨床病理指標間的關系 在60例胃癌標本中THBS4mRNA陽性表達39例，陽性表達率65.0%。男性表達23例，陽性率60.5%，女性中表達16例，陽性率72.7%，差異無統計學意義(P＞0.05)。在不同的年齡組THBS4mRNA的表達差異無統計學意義(P＞0.05)。在高分化組中THBS4mRNA的陽性表達率為50.0%，中分化組陽性表達率為47.6%，低分化組陽性表達率為82.7%，在組內進行兩兩比較，高分化與中分化胃癌的表達差異無統計學意義(P＞0.05)，與低分化的胃癌相比差異有統計學意義(P＜0.05)。中分化組與低分化組相比差異有統計學意義(P＜0.05)。有淋巴結轉移組THBS4mRNA陽性表達率為78.8%，無轉移組陽性表達率為48.1%，差異有統計學意義(P＜0.05)。THBS4mRNA陽性表達在臨床分期差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 胃癌組織中THBS4 mRNA在不同臨床病理指標的表達

2.3 免疫組織化學檢測結果

2.3.1 THBS4蛋白的在胃癌組織中的表達:在胃癌組織檢測THBS4蛋白的表達:在正常胃黏膜細胞胞漿內無棕色顆粒，在高分化胃癌組織中有癌細胞胞漿著色，染色較淡。在中分化的胃癌細胞中棕色顆粒染色加深，低分化胃癌細胞胞漿及胞核內彌漫出現深染的棕色顆粒 (圖2)。

圖2 THBS4在不同胃黏膜組織中的表達

2.3.2 胃癌組織中THBS4蛋白陽性表達與病理指標之間的關系:在60例胃癌組織中THBS4蛋白陽性34例，陽性表達率為56.7%，THBS4蛋白的陽性表達與胃癌患者的年齡及性別差異無統計學意義(P＞0.05)。THBS4蛋白在胃癌高分化組陽性表達率為40.0%，在中分化陽性表達38.1%，在低分化組陽性表達為75.8%，與低分組相比差異有顯著性(P＜0.05)。THBS4蛋白的陽性表達在淋巴轉移組高于無淋巴結轉移，差異有統計學意義(P＜0.05)。THBS4蛋白的陽性表達在臨床病理分期差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表2。

表2 胃癌組織中THBS4蛋白陽性表達與病理指標的關系

3 討論

THBS4基因是THBS家族新成員，它的結構與這個家族其他成員基本相同，有一個球狀的氨基端和一個球狀的羧基端。N末端區域的氨基酸殘基與肝素結合調節細胞間接觸、游走、增殖及血小板聚集。C末端可與整合蛋白相關蛋白(IAP)結合，介導細胞粘附、游走、血小板聚集。但在N端缺少原膠原同源重復序列和備解素重復序列，兩個半光氨酸殘基在原膠原同源區，THBS4的這種分子結構決定了殘基的多肽性，而且THBS4的出現與該家族相比極大的限制了在其他組織中的表達，它高表達于正常心肌和骨骼肌［1］。它在心臟的發育和骨骼肌的發育中起了重要作用。THBS4是細胞外基質，它可以促進細胞的增生與黏附，可以促進神經細胞的成熟［2］。THBS4結構中由于沒有原膠原同源區來抑制血管內皮細胞增生;沒有備解素重復序列，不能誘導血管內皮細胞的凋亡，這可能是THBS4基因促進血管形成原因之一。THBS4在腫瘤中的研究較少，有學者在結直腸癌中研究發現，THBS4在結直腸癌中表達比正常腸黏膜還低，這種THBS4的表達缺失［3］，說明了THBS4可以導致腫瘤細胞的選擇性生長優勢。在有些腫瘤中過表達，可以顯著抑制腫瘤細胞生長的能力［4］。有學者研究THBS4基因與動脈粥樣的發生有關［5］。在本組實驗中THBS4蛋白在中低分化胃癌中表達比高分化胃癌高，在胞漿內的著色也隨著胃癌分化程度的降低而加深，差異有統計學意義(P＜0.05)。在淋巴轉移組中THBS4蛋白表達比無淋巴轉移組高，差異有統計學意義(P＜0.05)。THBS4-mRNA與蛋白在胃癌組織中表達說明 THBS4對細胞的增殖起了上調作用，促進了細胞大量增生。發生的機制不清楚，可能與THBS4特定的分子結構有關，THBS4基因使caspas3活性降低從而使本應進入凋亡程序的細胞沒有被識別，得以生存并增殖。有文獻報道THBS4正常情況下高表達在心肌和骨骼肌，在肺組織、胰腺、腦組織、結腸中僅有少量的表達，而在胎盤、肝臟、腎臟中無表達［6］。

綜上所述，THBS4基因是一種細胞外基質的糖蛋白，在胃癌組織中呈陽性表達，與胃癌的分化程度有關，在中低分化的胃癌中高表達，與浸潤深度有關，隨浸潤的深度陽性表達越高，與淋巴轉移有關，在淋巴轉移組陽性表達比無轉移組高。THBS4的陽性表達可以上調CTGF的表達，在高分化胃癌中CTGF的陽性表達低于低分化胃癌，差異有顯著性。THBS4通過P53蛋白的突變抑制了細胞的凋亡，促進胃癌細胞的增殖與分化;促進了內皮細胞的增生，有利于血管的形成。隨著THBS4蛋白陽性表達增高血管密度也增加，差異有顯著性。THBS4基因具有多種功能，在腫瘤的形成中通過多種途徑發揮作用。THBS4基因在胃癌中可作為判斷與預后的指標。

1 Lawler J，Duquette M，Whittaker CA，et al.Identification and Characterization of Thrombospondin-4，a New Member of the Thrombospondin Gene Family.JCell Biol，1993，120:1059-1067.

2 Arber S，Caroni P.Thrombospondin-4，an extrace uular matrix protein expressed in the developing and adult nervous system promotes neurite outgrowth.J Cell Biol，1995，131:1083-1094.

3 Greco SA，Chia J，Kelly J，et al.Thrombospondin-4 is a putative tumoursuppressor gene in colorectal cancer that exhibits age-related methylation.BMC Cancer，2010，10:494.

4 Lawler J，McHenry K，Duquette M，et al.Characterizationofhumanthrombospondin-4.Biol Chem，1995，270:2809-2814.

5 Frolova EG，Pluskota E，Krukovets I，et al.Thrombospondin-4 regulates vascul inflammation and atherogenesis.Circ Res，2010，107:1313-1325.

6 Adams JC，Watt FM.Regulation of development and differentiation by the extracellular matrix.Development(Camb)，1993，117:1183-1198.