冰溫保存腎表皮細胞及其滲透特性的實驗研究

梁飛，諸凱，2，王雅博

（1天津商業大學天津市制冷技術重點實驗室，天津300134；2天津大學中低溫熱能高效利用教育部重點實驗室，天津300072）

冰溫保存技術[1-2]是一種新的生物低溫保存方法。冰溫是指從0 ℃開始到生物組織凍結溫度（即冰點）為止的溫度區域，在這個溫度范圍內保存細胞，細胞內外都不產生冰晶[3-4]。與目前臨床醫學廣泛使用的生物冷凍保存方法相比，避開了冰晶對細胞造成傷害，而且有助于細胞機能的快速恢復。研究表明，當降溫速率小到一定數值時[5]，細胞內的水分有足夠的時間能從細胞內滲透出來，從而降低胞內自由水含量，通過這種方法可以很好的抑制胞內冰的產生，對細胞的低溫保存有促進作用[6-7]。

通常情況下，細胞保存前都會添加低溫保護劑（cryoprotective agent，CPA），以有效的降低細胞冰點[8-10]。在加入一定濃度的CPA后，細胞膜內外會出現滲透壓不平衡，導致水和CPA同時通過細胞膜進出細胞，細胞體積也隨之改變，當細胞體積變化超越細胞膜所能承受范圍，將會對細胞產生不可逆的損傷，即滲透損傷。決定細胞形態變化的參數[11-12]主要有兩個，細胞膜水滲透系數（Lp）和細胞膜 CPA的滲透系數（Ps）。對這兩個參數的研究有助于冰溫保存細胞技術的發展。

細胞膜對水分的滲透特性可以通過細胞體積隨外界環境（滲透壓）的變化來反映。研究表明，細胞膜腎表皮細胞的相變溫度在?5～?8 ℃，研究細胞冰溫保存過程，就應在0 ℃附近溫度范圍中測定細胞膜的滲透特性。眾多研究者利用多種方法對細胞膜的滲透特性進行了研究。Chen等[13]利用微型灌注設備，研究了鼠樹突細胞在二甲基亞砜溶液中的滲透系數，得到了 22 ℃下水的滲透系數為 0.17 μm/(atm·min)，CPA的滲透系數為0.63×10?3cm/min。Wang等[14]測量了4 ℃時牛卵母細胞在胚泡期和四分體時期的滲透參數，分別為0.08 um/(atm·min)、0.0011 cm/min 和 0.14 um/(atm·min)、0.0029 cm/min。Liu等[15]測量了常溫時兔卵母細胞在二甲基亞砜、乙二醇和甘油溶液中的滲透參數。

本研究選取了–4 ℃為冰溫保存溫度，選?。ìF行臨床使用的）4 ℃和0 ℃為對照實驗，并稱其為常溫保存溫度。主要研究內容是通過實驗的方法測量腎臟表皮細胞的滲透特性，主要有細胞的等滲體積（Viso）、非滲透體積（Vb）、細胞膜對水的滲透系數（Lp）及其活化能（Ea），細胞膜對CPA的滲透系數（Ps）及其活化能（Ea），并且對細胞進行長時間保存，對比細胞的存活率，找出最優保存溫度。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及實驗材料

儀器：光學顯微鏡，Olympus BX-51，日本；冷熱臺及控制系統，Linkam THMS600，英國；CCD圖像采集裝置；細胞培養箱；安全柜；Innovatis CASY?TT，Roche，瑞士。

實驗材料：DMEM培養基、小牛血清、雙抗、臺盼蘭染色劑、磷酸鹽緩沖液（PBS）、二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、丙三醇（GLY）。

實驗所用細胞為 293T細胞，將細胞放入完全培養基（90%DMEM培養基、10%小牛血清、1%雙抗——除特殊說明，本文所提到的百分比均為體積分數）中生長，配置好后放入細胞培養箱中培養，培養箱中保持溫度37 ℃、CO2體積分數為5%的環境。待細胞培養成熟后，將培養皿取出，在安全柜中操作將培養液吸入離心管，以800 r/min的轉速離心5 min，然后利用血球計數板配置出4×105/mL細胞懸液。

1.2 實驗方法

1.2.1 圖像采集

細胞的精確控制溫度通過一套冷熱臺及其控制系統實現，如圖1所示。左側a部分是該系統的控制部分，由冷熱臺（BCS-196）、CCD 圖像數字采集系統、溫度控制臺（Linksys32）和PC端成像軟件組成。樣品池放置在顯微鏡（Olympas BX51）載物臺上，可實現在–196～125 ℃范圍內降溫和加熱，還可以實現以0.1～150 ℃/min的降溫/升溫速率精確控溫。該冷臺通過液氮流進行降溫，通過電加熱進行加熱，并且通過鉑電阻熱電偶對其溫度進行監測[16]。

圖1 冷熱臺及其控溫系統和細胞滲透原理圖

圖1右側b部分是細胞滲透原理的示意圖，為更清楚表達實驗過程，將該部分的圖形比例擴大表示，尤其是細胞的尺寸。如圖所示，載玻片和蓋玻片之間充滿細胞懸液，由于液體表面張力的作用，是兩玻片緊緊吸附，保證了玻片之間是單層細胞。高濃度的灌注液（冷凍保護液或 NaCl 溶液）從左側導入，灌注溶液的濃度高于細胞培養液的濃度，其濃度差是驅動灌注液從左向右流動的動力，兩者混合后從右側流出平，最終細胞周圍溶液的濃度會達到灌注液的濃度，細胞在此過程中，形態會產生變化，通過正上方的鏡頭傳入a部分的計算機成像軟件[17-18]。

1.2.2 圖像處理方法

本研究通過顯微鏡觀察法測量細胞的體積，假設細胞為理想球體模型，通過上述系統可得到實驗過程中的細胞圖片，通過測量細胞的二維投影面積，再經過計算可以推斷細胞的體積。Image-Pro plus圖像分析軟件將細胞圖片處理成灰度不同的像素點，在500倍鏡下，每個像素點對應的面積為0.138 μm×0.138 μm，通過對像素點計數，可得到細胞的實際面積。每次選取3～5個細胞，測量3次，求平均值。低溫顯微鏡得到的二維投影面積與體積的關系如式（1）。

1.2.3 細胞非滲透體積Vb的計算

將滲透壓濃度為118 Osmoles/kg、185 Osmoles/kg、260 Osmoles/kg、302 Osmoles/kg、670 Osmoles/kg、863 Osmoles/kg、1349 Osmoles/kg、1583 Osmoles/kg、1741 Osmoles/kg、2252 Osmoles/kg、2682 Osmoles/kg、2800 Osmoles/kg、3186 Osmoles/kg 的 NaCl溶液，按上述方法進行細胞滲透試驗。細胞分別會對以上溶液呈現出不同的相應，最終細胞的內外溶液會達到滲透平衡，細胞體積的變化過程由圖像采集系統記錄下來，其最終的平衡體積Veq可以表述為Boyle van’t Hoff關系式[19]，如式（2）。

式中，Viso為細胞在等滲溶液中（即滲透壓為Miso，mmol/kg）的體積，一般取細胞的初始體積，μm3；Veq為細胞在滲透壓為M的溶液中的平衡體積，μm3；Vb為細胞的非等滲體積，μm3。

從式（2）可以看出，細胞的相對體積Veq/Viso與溶液的相對滲透壓M/Miso的倒數呈線性關系，將實驗數據作圖并進行線性擬合，可以得到直線在y軸的截距即為細胞的非滲透體積比Vb/Viso。

1.2.4 細胞膜滲透參數（Lp、Ps）的測定

當溶液中只有非滲透性溶質（如NaCl）存在時，水的滲透系數可以利用一個描述水分傳輸率的微分方程得到，如式（3）。

在有可滲透性溶質（CPA）、不可滲透性溶質（NaCl）和溶劑（H2O）共存的三元溶液中，水的傳輸和CPA的滲透同時存在并且相互影響，可采用兩參數模型（The two-parameter model）[20-21]來描述作為細細胞膜傳輸動力模型，模型由一對耦合的微分方程組成，式（4）表示細胞體積隨時間的變化，式（5）表示胞內可滲透性溶質（CPA）的物質的量隨時間的變化。

其中，Vs（t）與Ns（t）的關系如式（6）。

Lp、Ps的值可以通過將高滲CPA溶液灌注入細胞懸液后所獲取的細胞體積變化數據進行最小二乘曲線擬合得到。

1.2.5 活化能Ea的計算

通過上面分析，Lp、Ps可以通過分析實驗數據得到，同時，Lp、Ps所對應的活化能可以用阿倫尼烏斯關系式[22][式（7）]表示。

式中，P為細胞膜的滲透參數（Lp或Ps）；P0為在參照溫度下的值。

對式（7）取自然對數，整理得式（3）。

由此可知，ln(P)是關于1/T的方程，將計算值與溫度值做線性擬合，其斜率為?Ea/R，由此可以得到活化能的值。

1.2.6 細胞存活率實驗

為了研究冰溫保存細胞的效果，將不同的冷凍保護劑加入細胞懸液中，放入冰溫庫進行長時間保存，利用細胞計數分析儀 Innovatis CASY?TT（Roche）檢驗細胞的存活率。

將細胞濃度為 4×105/mL的細胞懸液配置好之后，分別進行以下兩組實驗：①向細胞懸液加入15%的DMSO試劑，分別放入不同的環境溫度中（4 ℃、0 ℃、–4 ℃），每12 h記錄一次存活率，到48 h為止。②向細胞懸液中分別加入15%不同種類的低溫保護劑二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、甘油（GLY），并放置于–4 ℃的環境溫度中，每12 h記錄一次存活率，到48 h為止。

2 結果與討論

2.1 細胞非滲透體積的測量

當細胞在高滲溶液中時，細胞內水分外流，體積發生皺縮，當細胞內外滲透壓相等時，細胞體積達到滲透平衡。在常溫下，記錄細胞在不同滲透壓NaCl溶液內的滲透平衡過程的圖像，利用上述圖像處理方法對不同滲透壓下的平衡體積進行處理。首先，測量細胞在等滲溶液中的體積，通過多次觀察統計，腎表皮細胞的平均等滲體Viso=2472.58 μm3。然后，測定細胞在不同滲透環境中平衡后的體積數據，得到腎表皮細胞隨滲透壓變化規律，如圖2所示，并進行最小二乘法線性擬合，得到Boyle van’t Hoff曲線，并且外延該直線至無限大濃度，即圖2中y軸截距位置，可以得到細胞的非滲透體積Vb=0.22Viso，即Vb=543.9676 μm3，其擬合系數r2=0.96175。

2.2 細胞滲透系數的測量

細胞在高滲的 NaCl溶液中，在胞內外滲透壓差的作用下，水分會通過細胞膜流出細胞。而 Na離子進出細胞需要消耗能量，它對細胞膜來說是一種非滲透性溶質，因此只有水分子通過細胞膜，如圖3所示，在75 s以后，細胞體積下降到0.45Vb左右保持滲透平衡，在一定范圍內保持穩定。這說明在整個滲透過程中只有水分進出，而 Na離子未轉移。將細胞變化圖片在軟件中進行處理，得到細胞體積隨時間變化的數據，利用Matlab（MathWorks，美國）軟件進行處理，根據式（3）采用Levenberg-Marquard法進行曲線擬合，可得到水的滲透系數Lp，如表1列出了3種低溫保護劑在不同溫度時的滲透參數值。

圖2 腎表皮細胞的Boyle van’t Hoff關系曲線

圖3 細胞在NaCl溶液中時體積隨時間的變化曲線

圖4左圖顯示的是初始時刻，0 ℃時細胞在15%的二甲基亞砜溶液中的圖像，右圖顯示的是左圖方框中細胞在0～300 s內，各個時間點的體積變化圖像，通過Image-Pro plus軟件處理可得到細胞體積的數據。通過數據可以得到細胞在二甲基亞砜溶液中的體積變化曲線，如圖5和圖6所示。在50 s附近時，細胞體積降到最小值，在以后的時間內，細胞體積逐漸上升，該圖與圖3相比有很大區別。很顯然在50 s前，細胞外溶液滲透壓大于胞內，水分從細胞內流出，細胞體積急劇減小，在50 s左右達到平衡；在50 s之后，隨著二甲基亞砜分子逐漸進入細胞，水分重新回到了細胞內，因此細胞體積有所回升。將細胞體積變化數據，根據式（4）～式（6）利用 Levenberg–Marquard方法進行曲線擬合，可得到水的滲透系數Lp和DMSO的滲透系數Ps，數據見表1。

表1 腎細胞在不同低溫保護劑中的滲透參數

圖4 15%的DMSO溶液中細胞圖像

圖6 –4 ℃時細胞體積變化曲線

圖5是在0 ℃、4 ℃和–4 ℃下，細胞在15%的二甲基亞砜溶液中的體積變化曲線。觀察可知，細胞體積變化趨勢一致，都是細胞體積先急劇減小，然后逐漸變大。但是，在同一時間點上溫度越低，細胞體積越大。同時，隨溫度的降低，細胞皺縮到最小體積的時間越長，這個最小體積也隨溫度的降低而增大。這是由于溫度對低溫保護劑的滲透系數影響所造成的，觀察表1的數據可知，二甲基亞砜的Lp和Ps值均隨溫度的下降而減小，說明水和二甲基亞砜的滲透能力均隨溫度的下降而降低，尤其是在–4 ℃時，Lp和Ps值均比零上溫度低一個數量級，這正說明了滲透參數受溫度影響嚴重。

圖6是細胞在二甲基亞砜、乙二醇和甘油溶液中的體積變化曲線，觀察曲線可知，三者曲線變化趨勢一致，在同一時間點上，甘油的體積最大，二甲基亞砜和乙二醇的體積相差不大。甘油的曲線下降的最慢，最小體積也是三者中最大的，二甲基亞砜和乙二醇的曲線比較相似，根據表1數據可知，二甲基亞砜和乙二醇在各個溫度的滲透參數都比較接近，而甘油的滲透參數小于上述兩者，可見甘油的滲透能力最下小。

2.3 滲透系數所對應的活化能

圖7顯示的是細胞在二甲基亞砜溶液中測得的水的滲透系數Lp與絕對溫度T的倒數關系圖，對其進行最小二乘法線性擬合，根據式（8）可以計算得到細胞對水的活化能。利用同樣方法可得到其他CPA中活化能的數據，見表2。

2.4 細胞的存活率

在經過冰溫保存過程中，細胞的質量會隨著時間逐漸下降，細胞活性逐漸降低，直至變為死細胞，一般認為，當活細胞的存活率下降到50%以下時，生存環境惡化，組織將壞死。

圖7 腎細胞對水的滲透系數的阿侖尼烏斯圖

表2 腎細胞的活化能

圖8 不同溫度下腎細胞存活率曲線

通過上述方法，利用細胞計數分析儀Innovatis CASY?TT對冰溫保存的細胞進行計數測量，得到細胞存活率數據。由圖8可見，細胞在36 h之前，曲線小幅度平穩下降，說明細胞在這段時間沒有經歷太大變化，依舊保持活性；在36 h之后， 曲線出現大幅下降，說明細胞開始出現大量的壞死，在達到72 h的時候，存活率均低于50%，已經不能在進行培養。觀察可知，0 ℃曲線在各個時間點基本都高于其他曲線，?4 ℃曲線的次之，4 ℃曲線最低，這說明相對其他兩個溫度來說，0 ℃的環境對細胞保存最有益，最佳保存溫度在0～?4 ℃之間。圖9顯示了0 ℃時細胞在3種低溫保護劑中保存后存活率的曲線，其變化趨勢與圖8的趨勢相似，同樣說明在36 h之前，細胞生長良好，能保持很高的活性，在36 h之后，細胞出現大量壞死。同時，3種冷凍保護劑中，甘油的曲線高于其他兩曲線，在36 h之前，二甲基亞砜的曲線和甘油的曲線非常相似，乙二醇的曲線最低，這說明針對腎臟表皮細胞而言，3種低溫保護劑對甘油和二甲基亞砜的保護作用較好，乙二醇相對較差。

3 結 論

本文利用顯微數字圖像采集系統，在冰溫溫度和常溫溫度下，對腎臟表皮細胞的滲透過程進行了研究。觀察了細胞在非等滲環境中的滲透響應，得到了細胞的等滲體積Viso=2472.58 μm3，非滲透體積Vb=543.9676 μm3。并且根據細胞在CPA溶液中的滲透過程，得出了細胞膜對水的滲透系數（Lp）及細胞膜對 CPA的滲透系數（Ps）。最后進行保存，利用細胞計數分析儀測量了細胞存活率隨時間變化趨勢。得出如下結論。

圖9 0 ℃時不同保護劑中細胞存活率曲線

（1）通過對比低溫保護劑在不同溫度下滲透系數的數據，發現滲透系數受溫度影響較大，隨著溫度的減小，滲透系數逐漸小，其滲透能力也相應降低，即細胞在冰溫環境下的滲透系數低于常溫下的滲透系數。

（2）通過觀察細胞在不同溫度下的保存狀況，發現腎表皮細胞的最佳保存溫度范圍在 0～?4 ℃之間，即細胞的冰溫保存效果比現行臨床常用的4～0 ℃范圍的保存效果更好。同時根據實驗數據發現，即使在精確控溫的冰溫庫中保存的細胞，保存時間不宜超過36 h，超過以后細胞質量急劇下降，影響細胞功能。因此在實際臨床應用上，保存時間更不宜超過24 h為好。

（3）通過觀察細胞在不同類型低溫保護劑中的保存情況，發現在36 h內，甘油、二甲基亞砜、乙二醇3種低溫保護劑的保存效果，依次降低，但是三者的保存效果相差不大。

符 號 說 明

A——細胞投影面積，μm2

Ea——活化能，kcal/mol

Lp——水對細胞膜的滲透系數，μm/(atm·min)

M——摩爾滲透壓濃度，Osmoles/kg

m——質量摩爾濃度，mol/kg

N——物質的量，mol

Ps——CPA對細胞膜的滲透系數，cm/min

R——氣體常數，kcal/(mol·K)

T——絕對溫度，K

t——時間，s

V——細胞體積，μm3

Vb——非滲透體積，μm3

下角標

c——總數

w——水

s——分滲透性溶質

n——滲非透性溶質

o——初始值

上角標

e——細胞外

i ——細胞內

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