3株厭氧產電菌的分離與特性

鄒然，朱葛夫，張凈瑞，劉紫璇，劉超翔，黃栩

（1中國科學院城市環境研究所，福建 廈門 316021；2蘭州理工大學土木工程學院，甘肅 蘭州 730050）

對微生物燃料電池（MFC）的研究發現，外加一定電壓可使體系在降解污染物的同時產生氫氣，Logan等[1-2]于2005年首次把這種新的產氫技術稱為微生物電解池（MEC）。目前對MEC的研究主要以MFC已有的研究成果為基礎，重點集中在以下4個方面：反應器的設計[3-4]，底物的選擇[5-6]，電極材料的優化[7-8]，微生物的研究[9-10]。產電菌作為MEC的重要微生物，在降解有機物和轉移電子方面發揮重要作用。但目前，大部分產電菌是從 MFC中分離出來后應用于MEC中，直接從MEC中分離出來的產電菌較少[11-12]。而已經從MFC中分離出的產電菌種類主要有地桿菌 （Geobacteracae）[13]、 希瓦氏菌 （Shewanella）[14]、 假單孢菌（Pseudomonas）[15]、梭菌（Clostridium）[16]、脫硫單菌（Desulfuromonas）[17]和鐵還原紅育菌 （Rhodofoferax ferrireducens）[18]等。其中以地桿菌、希瓦氏菌和假單孢菌屬的研究居多，而其他種類的產電菌少見報道。

厭氧“發酵障礙”是厭氧代謝中的一大難題?！鞍l酵障礙”是指在厭氧代謝過程中，中間產物揮發酸的積累抑制發酵菌群對有機物進一步的降解，從而降低微生物對碳源的利用率，影響系統的穩定性[19-20]。而產電菌群能夠以多種厭氧代謝中間產物作為底物生長，若將產電菌群引入厭氧代謝體系中，實現產酸發酵菌群和產電菌群對有機物梯級利用，則能夠為厭氧代謝提供一種新途徑。而實現產酸菌和產電菌生態位的耦合則是達到這一目的的關鍵，因此，篩選分離出能以多種揮發酸為底物、耐酸能力較強、具有較強電化學活性產電菌的研究工作顯得尤為重要。

本研究中以 MEC電極生物膜作為產電菌分離的菌源，采用Hungate厭氧菌培養技術成功分離出3株產電菌，通過考察其生理生化特征探討了其應用于解決厭氧“發酵障礙”的可行性。同時，測定了菌株產電活性，為探討其在 MFC中的應用潛力和范圍提供了依據。

1 材料與方法

1.1 菌種的分離和純化

1.1.1 菌種來源

用于分離產電菌的微生物樣品取自本實驗室運行的一個單室MEC。該MEC是以乙酸鈉為底物，以產氫氣為主要目的。樣品采集時，MEC已穩定運行 90天，其期間的氫氣產率為(2.8±0.1) mLH2/(mgCOD)，能量效率值為138.6±3.1%。

1.1.2 培養基

液體培養基的組成：胰蛋白胨4.0 g/ L、牛肉浸膏4.0 g/ L、酵母1.0 g/ L、CaCl20.2 g/ L 、NaCl 5.0 g/ L、乙酸鈉16.0 g/ L、FeSO4.7H2O 0.2 g/ L、MgCl20.2 g/ L、K2HPO41.2 g/ L、半胱氨酸1.0 g/ L、檸檬酸鐵5.0 mmol/L、M液和V液各5.0 mL/L[21]、1 g/L的刃天青0.4 mL/L，調節pH值為7。

固體培養基的組成：在液體培養基的組成成分之外再加入15～20 g/L的瓊脂粉。

1.1.3 分離操作方法

在厭氧無菌條件下，從 MEC電極膜上裁剪一小片（2.0 mm×2.0 mm），投入含已滅菌的液體培養基的厭氧瓶中，密封后置于37 ℃條件下富集培養5天。將富集后的液體培養基進行梯度稀釋，選擇10?4、10?5、10?6、10?74 個稀釋度的菌懸液接入固體培養基中，冷水浴中滾管后，垂直放置于37℃恒溫培養箱中厭氧培養 1～2 周。選擇大小適中、相距較遠的菌落，用接種針在無菌厭氧環境中將其接種于液體培養基中擴大培養5天。重復上述滾管分離和擴大培養操作4次，至滾管中固體培養基上形成的菌落形態相對一致。

1.2 16S rDNA基因擴增與測序及系統發育樹的構建

對分離得到的單菌落進行擴大培養后，吸取部分菌液離心并收集的菌體。采用美國OMEGA公司的土壤DNA試劑盒提取DNA。PCR擴增引物為：27F （ 5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′） 和1492R（5′-TACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR 反應條件為：94 ℃預變性3.00 min、94 ℃變性l.00 min、54 ℃退火0.75 s、72 ℃延伸1.50 min、30個循環，最后72 ℃延伸5.00 min。PCR產物分別通過瓊脂糖電泳和Nanodrop （Thermo Fisher Scientific）定性和定量。經切膠純化的PCR產物交由上海美吉生物技術有限公司完成測序。將菌株的16S rDNA測序結果提交GenBank核酸序列數據庫進行BLAST比對，使用DNAMAN將其與同源性較高的產電菌的16S rDNA序列進行比對，采用最大似然法繪出系統發育樹并進行穩定性檢驗（1000次）。根據測序結果確定3種細菌作為進一步研究對象，分別標記為Z1、Z2和Z3。

1.3 形態特征觀察和生理生化實驗

首先對3種細菌進行了革蘭氏染色，并采用穿刺法測定了其厭氧特性。菌株的形態特征采用日本日立掃描電鏡（S-4800）進行觀察，樣品首先用2.5%戊二醛固定4 h，然后用0.1 mol/L 磷酸緩沖液清洗3次，每次15～30 min，最后用50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇和100%乙醇各洗脫30 min。觀察前通過日本日立臨界點干燥儀（HCP-2）進行干燥，用電子濺射鍍膜儀（Gatan Model 682）在表面鍍一層15.0 nm厚度的金屬膜，再進行觀察拍照。

接著，選擇初始pH值、溫度、NaCl濃度、碳源 4個參數的不同水平研究了菌株的生理生化特點。初始pH值的水平設為4、5、6、6.5、7、7.5，溫度水平設為15 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃，NaCl質量分數為0、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%，碳源選擇蔗糖、淀粉、葡萄糖、丁酸鈉、丙酸鈉、乙酸鈉。實驗中，以2.0%（體積分數）接種量將菌懸液接種到裝有10.0 mL培養液厭氧管中，分別在各參數的不同水平下培養24 h，以未接種的培養液作為空白對照，采用紫外分光光度計在波長660.0 nm處測定各組試驗的OD值。

1.4 產電性能測定

通過循環伏安法測定3株純菌的產電性能，實驗設置空白組和實驗組，空白使用無菌水溶液，實驗組為添加菌液的溶液。采用Ag/AgCl為參比電極，玻碳電極為工作電極，掃描速率50.00 mV/s，掃描范圍?600.00～600.00 mV。

采用單室MFC反應器啟動，陽極和陰極分別采用碳布（2.0 cm×4.0 cm）和不銹鋼網（2.0 cm×4.0 cm），外阻為10 ?，以鈦絲構成閉合回路，系統采用間歇式方式運行。啟動的接種污泥取自廈門市集美區污水處理廠二沉池，污泥的MLSS和MLVSS分別為16.78 g/L和9.2 g/L，陰極液和陽極液都為葡萄糖為碳源的營養緩沖液，并加入微生物生長所需的微量元素。將菌株Z1、Z2和Z3擴大培養獲得的菌懸液以1∶1∶1的體積比混合形成接種物，并以該接種物與 MFC接種污泥混合，考察了其對MFC啟動和產電性能的強化作用。試驗中設置實驗組R1和對照組R2，R1為加入5.0%（體積分數，下同）的產電菌混合物（OD660nm值為1.10）和15.0%接種污泥的MFC，R2為只有15.0% （接種污泥的MFC，兩組共運行3個周期，每個周期中當輸出電壓值小于20.00 mV的時候更換營養液，進入下一個周期的實驗。

2 結果與討論

2.1 分子生物學鑒定及系統發育學分析

通過厭氧培養和分離操作分離得到 3株純菌Z1、Z2和 Z3，將菌株的 16S rDNA序列提交GenBank，將其16S rDNA序列在GenBank中進行BLAST比對。結果表明，Z1與Citrobactersp.Z7和Citrobactersp.LY2兩種菌的相似性達到99.0%，Z2與Clostridiumsp.NHT33和Clostridiumsp.NHT54兩種菌的相似性達到 99.0%；Z3與Clostridiumsp.PPf35E10和Clostridiumsp.YN5兩種菌的相似性達到99.0%。以分離的3個菌株與其遺傳相似性較高的6個菌株構建系統發育樹，結果如圖1所示。從圖1中可以看出，菌株Z1屬于檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），菌株Z2和Z3屬于梭菌屬（Clostridium）。雖然本研究中分離出來的Z1、Z2、Z3菌株分別與Citrobactersp.Z7、Clostridiumsp.NHT33、Clostridiumsp.PPf35E10等6株菌相似性較大，但關于此類菌株的生理生化特征及應用領域的研究少見報道。因此，有必要對所分離菌株進行生理生化特征及其在解決厭氧“發酵障礙”和MFC應用潛力方面的探究。

2.2 菌株革蘭氏染色與SEM形態特征觀察

Hungate滾管固體培養基中3株菌落都接近圓形，直徑約0.5 cm，表面光滑，菌落邊緣整齊，中間顏色較深，邊緣顏色較淺。Z1有帶絲狀，為微黃色，Z2和Z3菌落為乳白色。革蘭氏染色結果表明，菌株Z1為革蘭氏染色陰性（G?），Z2和Z3為革蘭氏染色陽性（G+）。厭氧性測定結果為Z1為兼性厭氧菌，Z2和Z3為嚴格厭氧菌。圖2為3個菌株的SEM 照片，從中可以看出，菌株 Z1 、Z2 和 Z3的菌體均為桿狀，長約2.0～3.0 μm，寬約0.4～0.6 μm，單生，無鞭毛，Z1無芽孢，Z2和Z3有芽孢。菌株 Z1的上述特征與伯杰氏系統細菌學手冊中關于檸檬酸桿菌屬特征描述相符，而菌株Z2和Z3的上述特征則與梭菌屬的特征描述相符合[22-23]。

圖1 基于16S rDNA基因序列繪制的菌株Z1、Z2和Z3系統發育樹

圖2 菌株Z1、Z2和Z3的掃描電鏡圖像

2.3 菌株的生理生化特征

2.3.1 菌株生長的pH值范圍

pH值主要是從底物利用和對物質代謝途徑兩方面影響微生物的生理活動[21]。如圖3(a)所示，在初始pH值7.0的條件下，Z3的長勢最佳，而菌株Z1和Z2的最佳長勢則出現在pH值為6.5時。隨著pH值的降低，3株菌的長勢逐漸下降，但pH值在5.0以上時，其生長代謝活性仍然較強，表現出較強的耐酸能力。與已報道的Clostridium屬菌株[16]相比，菌株Z2和Z3具有更寬的pH值生長范圍。在厭氧發酵系統中產酸相的最佳 pH值范圍為 5.0～6.5，產甲烷相的最佳pH值范圍為6.5～7.5[24]。分析認為，分離得到的 3株細菌，其適宜的增殖 pH值范圍（5～7.5）與厭氧發酵系統的產酸相和產甲烷相的適宜pH值具有很好的匹配性，具有互營共生的潛力。

2.3.2 菌株的生長溫度范圍

從圖3(b)中可以看出，在 15～40 ℃范圍內，菌株Z1、Z2、Z3都能生長，但溫度的變化對菌株的生長影響顯著。從15 ℃開始，隨著溫度的升高，3個菌株的增殖加速，Z1的最適生長溫度為35 ℃，而Z2、Z3最適生長溫度為30 ℃，當溫度高于最適溫度時，菌株的增殖受到抑制，長勢迅速下降。一般厭氧代謝體系的最佳溫度范圍為 25～35 ℃[25]，因此，菌株Z1、Z2和Z3在溫度方面也與厭氧發酵系統具有良好的匹配性。

2.3.3 菌株的NaCl濃度耐受范圍

圖3 菌株的生理生化特征

離子強度能對 MFC的產電性能產生重要影響，因為較高離子強度將有利于電子傳遞，但同時可能會影響電極膜上產電菌的活性[26]。由圖3(c)可知，菌株Z1、Z2和Z3在NaCl質量分數為0.5%時生長良好，隨著NaCl濃度增加生長速率下降，NaCl質量分數達到5.0%時基本不生長，耐鹽性不強，其最適NaCl質量分數為0.1%～2.0%。

2.3.4 不同碳源底物利用情況

從表1可以看出，3株菌株能都能利用蔗糖、淀粉、丙酸鈉、乙酸鈉作為碳源生長，Z2和Z3菌株還能夠利用葡萄糖作為碳源生長，Z1能夠利用丁酸鈉作為碳源生長。這與已有的研究相似，Park等[16]從以淀粉作為電子供體的 MFC中分離出來的丁酸梭菌（Clostridium butyricumEG3）能以淀粉、纖維二糖、蔗糖等為碳源；Niessen等[9]也發現同屬的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）能利用淀粉、葡萄糖和乳酸為碳源等產電。而本研究中分離出的3株產電菌不僅能以多糖（淀粉）為碳源，還能以厭氧代謝中間產物（揮發性有機酸）為碳源生長，這為其與厭氧發酵產酸菌形成傳質鏈的可行性提供了理論基礎。此外，菌株底物的廣譜性，對擴大MFC的應用范圍具有較大的指導意義。

表1 菌株碳源利用情況

2.4 產電活性試驗

2.4.1 循環伏安曲線測定

在循環伏安曲線中，峰高越高，氧化還原電勢越高，細菌的產電能力越強，產電性能越好[27]。如圖4所示，菌株Z1、Z2和Z3在?0.29 V左右都出現了明顯的還原峰，氧化峰不明顯，表明3株菌株具有相似的產電特征，且還原能力較強。在目前研究獲得的產電菌，大多具有較強的氧化能，而還原能力較強的產電菌報道較少[28～30]，這可能與大部分研究關注于產電菌在 MFC陽極發揮作用有關[31]。然而，對于 MFC中應用較為普遍的催化陰極（鉑和鎳等）而言，因其在反應中容易失活，而造成反應體系不穩定[32]。因此，對生物陰極的研究需要加強，而且生物陰極的還原特性使其在高氯酸鹽降解、重金屬修復以及生物質能源產生方面具有較大應用前景[33-35]。

圖4 菌株循環伏安曲線

2.4.2 產電菌對MFC啟動和產電性能的影響

MFC啟動運行結果見圖5。由圖5可見，在MFC啟動運行的第一個周期中，R1運行12 天后，系統的輸出電壓即達到了20.00 mV，最高輸出電壓達到350.00 mV。而R2運行15 天后期系統輸出電壓方達到20.00 mV，其最高輸出電壓為317.80 mV?？梢?，產電菌的加入，不僅可以提高 MFC的反應周期，而且可以有效提高 MFC的產電效能。在隨后的兩個運行周期中，R1和R2的最大輸出電壓具有顯著提高，但基本穩定，分別維持在482.50 mV和408.60 mV左右，也即R1的最大輸出電壓較R2增加了18.1%。

圖5 MFC啟動運行

分析認為，MFC在每個運行周期所表現出的電壓迅速升高現象，是源于底物的充足。而隨著有機物的不斷降解，微生物因營養逐漸匱乏而活性下降，導致了MFC輸出電壓的降低。MFC的啟動實際上是產電菌和其他種群微生物競爭后，在電極表面附著從而形成生物膜，同時轉移電子和輸出電壓的過程。所以，產電菌的種類及能否形成優勢種群是MFC成功啟動的關鍵影響要素。R1中接種入分離的產電菌株后，豐富了產電菌的種類，增加了產電菌數量，從而有效縮短了運行周期，提高了輸出電壓。而這一結果同時證明了菌株Z1、Z2和Z3能夠在以葡萄糖為底物、活性污泥為種源的 MFC系統中具有較強的生存能力，表現出了良好的種群競爭優勢，可為強化MFC效能提供微生物種質資源。

3 結 論

（1）從MEC陰極的生物膜上分離得到3株產電菌 Z1、Z2和 Z3，Z1屬于檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），Z2和 Z3屬于梭菌屬（Clostridium），3株菌株均具有較強還原能力。

（2）菌株Z1、Z2和Z3均為桿狀菌。其中，Z1為G－，Z2和Z3為G+。Z1為兼性厭氧菌，Z2和Z3為嚴格厭氧菌。3株產電菌能夠利用淀粉、單糖和揮發性脂肪酸為碳源生長。在pH值5～7.5的環境中增殖良好。Z1的最適生長溫度為35 ℃，Z2、Z3最適生長溫度為30 ℃。3株菌株在生理生態特征方面與厭氧發酵系統具有良好的匹配性能。

（3）在MFC啟動時，加入菌株Z1、Z2和Z3的混合物，可顯著縮短 MFC的啟動周期，同時有效提高MFC的產電效能。

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