超臨界二氧化碳相轉化技術制備組織工程支架研究進展

楊丁柱 ，陳愛政 ，2，王士斌 ，2

（1華僑大學化工學院，福建 廈門 361021；2華僑大學生物材料與組織工程研究所，福建 廈門 361021）

組織工程的原理是將體外培養和擴增的高濃度功能相關組織細胞種植在一種生物相容性好，同時能夠在被機體降解的材料上，即組織工程支架，形成材料-細胞復合物，將此復合物移植到機體內，達到修復受損組織或重建功能的目的。組織工程支架作為組織工程的三要素之一，為種子細胞提供了適合其生長、基質合成及發揮其他功能的生物學空間，克服了以往單一細胞移植中細胞不易成活、基質合成能力低等缺點[1-2]。

目前，制備組織工程支架的傳統方法有：纖維粘結[3]、相分離/凍干法[4]、溶劑澆鑄/顆粒瀝濾[5]、氣體發泡[6]等方法。然而，傳統方法制備的組織工程支架普遍存在有機溶劑殘留多、孔洞貫通性差、生長因子容易流失等問題。隨著超臨界流體技術的不斷發展，其在多孔材料的制備領域研究廣泛，涉及多孔微球[7-9]以及多孔支架的制備[10]。在組織工程支架的制備方面，基于SC-CO2傳質性能的可調性，可以控制多孔支架的形貌；基于其和有機溶劑的高親和性，可以強化傳質速率，有效地去除有機溶劑，避免了上述問題的產生。因此，本工作從 SC-CO2作為非溶劑的角度，對利用 SC-CO2相轉化技術制備組織工程支架的研究現狀進行綜述，并對目前存在的問題提出了可能的解決方案，最后對其未來的研究和發展方向進行了展望。

1 超臨界二氧化碳相轉化技術

超臨界二氧化碳流體（supercritical carbon dioxide，SC-CO2）是指當溫度，壓力超過二氧化碳臨界點（Tc=304.1 K，Pc=7.38 MPa）時的流體，其具有接近于液體的黏度和接近于氣體的密度，這賦予了它較好的溶解性和擴散性；同時，由于CO2的介電常數較低，分子偶極矩為零，大多數高分子聚合物不易溶解在SC-CO2中[11-12]。SC-CO2相轉化技術是指利用SC-CO2代替傳統的非溶劑，當SC-CO2與聚合物均相溶液接觸后，SC-CO2誘導均相體系從穩態轉化成非穩態，隨即發生相分離。

圖1 溶劑/非溶劑/聚合物三元相圖

對于溶劑/非溶劑/聚合物三元體系來說，依據相分離發生在三元相圖（圖1）的不同區域，可以形成不同的結構。當溶劑從聚合物溶液中擴散出去的速率大于非溶劑進入溶液的速率，在相分離發生之前，聚合物的濃度升高、固化，最終形成致密的無孔結構；當三元體系進入臨界點上方的亞穩態區時，體系將發生聚合物貧相成核和生長的分相過程，隨著聚合物富相的固化，形成孔洞結構（圖1中A區域）；當三元體系進入非穩態區時，溶劑從聚合物溶液中擴散出去的量大于非溶劑的進入量，隨著聚合物富相的固化，形成兩相貫通的連續孔洞結構（圖1中B區域）；當三元體系進入臨界點下方的亞穩態區時，體系將發生聚合物富相的成核和生長，隨著聚合物富相的固化，形成顆粒狀結構（圖1中C區域）[13-14]。同時，由于 SC-CO2的傳質特性，能快速干燥聚合物，將相分離與干燥過程合二為一，避免了干燥過程容易發生的結構塌陷問題。通過改變操作條件，可以調節聚合物多孔結構的形貌和孔徑，實現了過程的可控性。

2 SC-CO2相轉化法制備組織工程支架

2.1 組織工程支架材料

2.1.1 非生物降解性高分子材料

非生物降解性高分子材料因其化學惰性、與體液接觸后不會發生反應、力學性能不會因為長期植入體內而發生變化以及易于成型和加工等優點，廣泛用于韌帶、血管、人體臟器、骨等人體組織及器官的修復和制造。SC-CO2相轉化技術最早應用在非生物降解性高分子材料多孔結構的制備方面。Kho等[15]和 Matauyama等[16]結合壓縮抗溶劑沉淀法（precipitation with compressed antisolvent，PCA），以 SC-CO2作為非溶劑，將聚合物溶液均勻地涂布在支撐板上，隨后浸沒在SC-CO2中。由于SC-CO2與有機溶劑互溶而對聚合物不溶，可誘導混合體系發生相分離，形成多孔結構。同時，在對聚合物進行干燥處理時，隨著操作壓力的降低，多孔結構沒有出現塌陷，保證了多孔結構的完整性。然而，大多數非生物降解性高分子材料生物活性較差，與組織不易牢固結合，限制了其在組織工程領域的應用。但是該方法的提出推動了 SC-CO2相轉化技術制備組織工程支架的研究與發展。

此外，SC-CO2不僅可以作為非溶劑誘導聚合物溶液發生相分離，而且可以萃取分離一些有機化合物或作為化學反應的介質促進反應的發生。Kim等[17]將聚碳酸酯（polycarbonate，PC）與聚乙二醇（PEG200）溶解在二氯甲烷中，利用SC-CO2誘導體系發生相分離。由于PEG200在SC-CO2中具有一定的溶解度，利用SC-CO2可以將PEG200從體系中萃取去除，獲得PC多孔膜。Barroso等[18]以甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸為聚合物單體，在SC-CO2中進行聚合反應，合成聚甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸（poly methyl methacrylate-comethacrylic acid，PMMA-co-PMAA）共聚物，隨后將PMMA-co-PMAA溶解在丙酮中，利用SC-CO2相轉化技術制備出具有 pH響應性的 PMMA-co-PMAA多孔膜。

2.1.2 生物降解性高分子材料

作為組織工程支架材料必須滿足以下條件[19-20]：①具有三維立體結構、高孔隙率和適合的孔徑，以保證植入細胞的粘附、增殖以及生長因子的滲入吸附；②可生物降解性，材料植入體內，在組織形成過程中逐漸降解，其降解速率應與組織形成速率相匹配；③生物相容性、細胞親和性，與細胞和鄰近組織直接或間接接觸時能保持相對穩定、無免疫原性；④一定的機械強度，在組織再生過程中，提供臨時支撐，從而使再生組織具有一定外形。

天然高分子材料具有良好的生物相容性、生物可降解性以及可被吸收利用等優點，被廣泛用于組織工程支架材料。殼聚糖是一種堿性氨基多糖，其結構和性質與天然細胞外基質中的主要組成氨基多糖相類似。Duarte等[21]通過改變溶劑種類，成功制備出孔洞均勻的殼聚糖支架。但天然高分子生物材料大多力學性能較差，如果單獨使用，可能達不到一些組織工程支架的要求。聚乳酸（polylactic acid，PLA）是典型的合成高分子生物材料，通過控制合成工藝，可以獲得不同力學性能，擁有良好生物相容性和生物可降解性的 PLA材料[22]。此外，利用SC-CO2相轉化技術制備組織工程支架時，將兩種[23-25]或兩種以上[26]不同生物材料進行復合使用，可以避免單一使用的缺陷；選擇合適的復合材料以及混合比例或共載藥物[27-28]，可以調整和提高組織工程支架的性能。

2.2 組織工程支架形貌

在組織工程構建過程中，組織工程支架的尺度可以控制組織的生長發育過程[29-30]：①支架的整體尺度（mm～cm），決定了形成組織的大小和形狀；②支架孔隙形貌和大小（μm），決定細胞的遷移、生長、營養物質的輸運、代謝物的排出等；③支架材料表面化學以及立體微觀結構（nm），能調節與其直接接觸的細胞的粘附、遷移和基因表達過程。尤其是支架表面的粗糙度、孔洞的大小以及孔洞之間的貫通性會對蛋白質的吸附、細胞的形態、定向生長及細胞特異反應產生重要影響[31-33]。

2.2.1 致密無孔結構

在 SC-CO2誘導聚合物溶液發生相分離時，相分離體系的壓力和溫度不是瞬時達到的，如果在相分離發生之前聚合物固化，將形成致密無孔結構。Xu等[34-35]的研究發現，在氯仿/SC-CO2/聚-L-乳酸（poly-L-lactide，PLLA）體系中，由于氯仿與SC-CO2具有較高的親和力，在SC-CO2誘導體系發生相分離之前沒有發生液-液分層，從而形成致密無孔結構；同時，過高的聚合物濃度，也有助于形成致密無孔結構[36]或由顆粒形成的致密結構[37]。如果聚合物溶劑的沸點接近操作溫度，相分離體系的升壓過程可能會促進溶劑從聚合物溶液中蒸發出來，產生致密無孔結構[21]。

2.2.2 孔洞結構

圖2 超臨界二氧化碳相轉化技術制得的無孔結構

Reverchon等[38]的研究結果表明，由于聚合物溶液均勻地涂布在支撐板上，其上表面可與SC-CO2快速、充分地接觸，如果在 SC-CO2誘導體系發生相分離之前，溶劑從聚合物溶液中流出，將產生致密的表面，致密表面的形成阻擋了溶劑的擴散，而在聚合物溶液內部的 SC-CO2會誘導體系發生相分離，從而獲得表面致密，其下多孔的非對稱孔洞結構[圖3(a)]。Matsuyama等[39]考察了 4種有機溶劑對乙酸纖維素（cellulose acetate，CA）多孔結構的影響。實驗結果表明，當溶劑與 SC-CO2之間的親和力降低時，多孔結構的孔隙率和孔徑會增加。這是由于降低溶劑與 SC-CO2的親和力，使溶劑擴散到 SC-CO2中的含量減少，延長了聚合物貧相成核和生長的時間，導致孔徑的增大[40-43]，形成如圖3(b)所示的胞腔狀孔洞結構[41]和圖3(c)所示的隧道狀孔洞結構[43]。Reverchon等[44]將 CA溶解在丙酮中，發現當降低聚合物濃度時，CA的形貌從致密無孔結構變成多孔結構，孔徑從2 μm增大到50 μm。這是由于聚合物濃度降低時，減小了聚合物溶液的黏度，與 SC-CO2接觸時分相較快，有利于形成較大的孔徑；同時，提高了孔洞之間的貫通性，形成如圖3(d)所示的連續孔洞結構。當增大SC-CO2體系的壓力時，SC-CO2的密度和溶解度增加，導致進入聚合物貧相中的非溶劑量增加，分相加快，使得最終獲得的平均孔徑增大；而升高溫度，一方面降低了溶液的黏度，容易形成大孔結構；另一方面，升溫降低了 SC-CO2的溶解能力，導致分相速度減慢，聚合物貧相成核和生長緩慢，而聚合物富相的固化導致孔徑減小。與溶劑種類、聚合物濃度以及壓力相比，溫度對多孔結構的影響較小[42-45]。

Tsivintzelis等[46]將改性的納米蒙脫石顆粒添加到PLLA體系中，獲得了PLLA納米復合多孔支架，與未加入蒙脫石的PLLA多孔支架[41]相比，添加納米顆粒會得到更均勻的孔洞結構和更大的孔徑，這可能是由于納米顆粒的存在影響了納米復合材料的結晶行為。Huang等[37]以N,N-二甲基乙酰胺為溶劑，制得的聚偏二氟乙烯（poly vinylidene fluoride，PVF）具有胞腔狀的孔洞結構，孔洞由PVF晶粒組成。這種顆粒狀孔洞結構[圖4(a)]和葉片狀孔洞結構[圖4(b)]可能是相分離體系中，液-液分層和結晶共同作用的結果[35，47]。

由于 SC-CO2與水之間的共混性較差，這限制了利用 SC-CO2相轉化技術制備水溶性聚合物多孔支架的發展。為了改善此不足，Reverchon等[48]提出一種水溶性聚合物相分離的新技術，即將有機溶劑與CO2共混，操作條件高于CO2的臨界點，但低于混合體系的臨界點，這樣既保證了有機溶劑對水的增溶作用，同時也保證了 SC-CO2對反應體系的可控性。通過此改進技術，使用助溶劑乙醇，可以獲得孔徑在0.5～4 μm之間的聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）多孔結構。Temtem等[49]使用助溶劑乙醇，以 1%乙酸酸化的水為溶劑，制備出具有顆粒聚集結構和多孔結構的殼聚糖支架。間充質干細胞體外培養表明，這些結構可以支持細胞的粘附和增殖。

圖3 超臨界二氧化碳相轉化技術制得的多孔結構

圖4 超臨界二氧化碳相轉化體系中結晶作用形成的多孔結構

Reverchon等[50]研究了兩種不同的載藥方式，即藥物懸浮于聚合物溶液和藥物溶于聚合物溶液，對聚甲基丙烯酸甲酯（poly methyl methacrylate，PMMA）多孔結構的影響。實驗結果表明，兩種載藥方式不影響多孔結構的原有形貌[圖5(a)]。但是，在藥物懸浮體系中，增加藥物比例伴隨著聚合物比例的下降；同時，藥物的存在可能會阻礙聚合物富相的固化，從而形成孔徑較大，表面粗糙的多孔結構[圖5(b)]。Cardea等[51]也發現，藥物的加入不會對多孔結構的形貌沒有產生影響。但是，利用懸浮載藥方式獲得的共載阿莫西林的聚偏二氟乙烯-六氟丙烯（poly vinylidene fluoride-co-hexafluoropropylene，PVDF-HFP）具有更好的緩釋效果。

2.2.3 三維納米纖維結構

在組織工程支架內部，過小甚至閉合的孔洞[36，47]會限制細胞的遷移，從而導致細胞在支架邊緣堆積，這種堆積又反過來限制營養物質和代謝廢物的運輸，進而形成壞死區。如果孔壁光滑[41]或孔徑過大[43]，會限制細胞的粘附，不利于細胞的生長。同時孔洞之間要具有貫通性，以便細胞可以更好的遷移、生長，并且保證生長因子在支架內部的流動。

Duarte等將淀粉與PLLA[24]、殼聚糖與PLLA[25]、淀粉與聚已內酯（polycaprolactone，PCL）[52]共混，驗證了利用 SC-CO2相轉化技術制備基于天然聚合物體系的多孔結構的可行性。三維多孔淀粉基聚合物具有粗糙的表面，內部具有微米以及大孔結構，這些微米結構能夠強化傳遞性能和增加細胞的粘附和增殖；同時，這些多孔結構具有高貫通性[52-53]。將藥物與多孔支架進行共載，這樣多孔支架不僅可以起到物理支持的作用，而且可以控制藥物的釋放以及促進細胞的增殖和分化。共載有地塞米松的淀粉/PLLA混合支架，能夠起到生骨介質的作用，直接促進干細胞朝著成骨分化[28]。生物活性玻璃具有良好的生物相容性和可加工性，其具有的表面活性可與人體骨組織形成生理結合[54]。Duarte等[26]將生物活性玻璃添加到淀粉基三維支架體系中。研究結果表明，生物活性玻璃的加入增加了材料表面的粗糙度，但沒有對聚合物基質的孔隙率或多孔結構的貫通性產生影響。同時發現復合支架可以誘導磷灰石層的形成，促進骨組織的再生。

圖5 超臨界二氧化碳相轉化體系中載藥前后制得的多孔結構[50]

圖6 超臨界二氧化碳相轉化體系中不同溶劑下制得的多孔支架表面形貌[55]

作者課題組[55]使用碳酸氫銨為支架的致孔劑，二氯甲烷、二氯甲烷/二氧六環、二氧六環為溶劑溶解 PLLA，將致孔劑與聚合物溶液混合均勻后進行壓片處理，隨后利用SC-CO2誘導體系發生相分離，制備出孔隙率高（>95%）、力學性能好（抗壓強度>10 MPa）、有機溶劑殘留量低（12 μL/L）以及大小孔洞并存，孔洞之間相互貫通的組織工程多孔支架。選擇二氯甲烷作為溶劑時，在多孔支架內部會形成孔壁光滑、大孔壁上分布著小孔的三維孔洞結構[圖6(a)]。然而，選擇二氧六環作為溶劑時，在多孔支架內部會獲得由納米纖維相互交聯形成的三維孔洞結構，即三維納米纖維結構[圖6(b)]。在組織工程構建過程中，由于材料表面的微環境與粘附的細胞直接接觸，所以材料表面的微觀拓撲結構對細胞行為有著非常重要的影響[56]。因此，制備出具有類似天然細胞外基質結構和功能的三維納米纖維組織工程支架至關重要。

3 結 語

目前，使用 SC-CO2替代傳統的非溶劑，可以成功制備出不同形貌的多孔結構，驗證了 SC-CO2相轉化技術制備組織工程支架的可行性。但是，仍然存在一些不足亟待完善：缺少 SC-CO2相轉化技術制備多孔結構的理論研究，不能全面、科學地解釋多孔結構的形成機理；在多孔支架內部無法形成復雜的三維結構，過小甚至閉合的孔洞尺寸會限制細胞的遷移，過大的孔洞尺寸不利于細胞的粘附；需要進一步提高組織工程支架的性能，為細胞的生長提供理想的生存環境。因此，針對 SC-CO2相轉化技術具有的獨特優勢以及所面臨的問題，今后的研究內容可以考慮從以下幾個方面入手。①推動SC-CO2相轉化技術制備多孔結構的熱力學行為和傳質機理的研究，一定程度上預測體系是否適合制備多孔結構以及判斷多孔結構的最終形貌。②選擇適合的材料及操作條件，控制相分離的發生過程，形成具有微米和納米并存的多孔結構，實現功能互補。同時，保證孔洞之間的貫通性，以便生長因子在支架內部的流動。③加強制備具有類似細胞外基質結構和功能的復合材料支架的研究。例如，可以嘗試將天然高分子材料、合成高分子材料以及無機生物材料復合使用，實現取長補短，相互補充。④由于支架材料表面的微環境對細胞的行為有著重要的影響，通過對支架材料進行改性處理，可以進一步促進支架材料與細胞之間的相互作用，誘導細胞分化從而實現器官修復和組織構建（作者課題組正在嘗試使用新的致孔劑和材料，期望在纖維表面可以形成多孔或分層結構，提高纖維表面的粗糙度，以便促進細胞活動）。希望通過SC-CO2相轉化技術制備出理想的組織工程支架，滿足不同的組織構建要求，促進組織工程支架的研究和發展。

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