化學發光免疫分析法檢測肝纖維化血清標志物的性能評價

張運洪，何 玲，黃建軍（江津區中心醫院檢驗科，重慶 402260）

肝纖維化甚至早期肝硬化如能及時發現并進行抗纖維化治療，均是可以逆轉的。肝纖維化血清學指標檢測的臨床應用極為廣泛，能夠為疾病診斷和患者預后判斷提供重要信息［1－2］。通常所說的肝纖維化四項（以下簡稱肝纖四項）指標即最為常用的肝纖維化血清學指標，包括透明質酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原 N端肽（PⅢP N－P）及Ⅳ型膠原（C－Ⅳ）。目前，化學發光免疫分析技術在上述指標臨床檢測中的應用已較為廣泛。本院2012年年底引進了國產化學發光免疫分析儀用于血清HA、LN、PⅢP N－P及C－Ⅳ檢測。根據美國病理家協會（CAP）和ISO15189文件對醫學實驗室的質量和能力的要求［3－4］，本實驗室參照美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）的相關文件，結合通用的評價模式，對上述四個項目的檢測精密度、加樣針攜帶污染率、準確度、線性范圍、參考區間進行了驗證和評價，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司生產的MAGLUMI 2000Plus型全自動化學發光免疫分析儀及配套檢測試劑（試劑批號：HA為051120714，LN為049120904，PⅢP N－P為052120908，C－Ⅳ為050120907）和標準品。可溯源至美國Sigma公司標準的LN、HA、C－Ⅳ質控品及可溯源至美國Biodesign公司的PⅢP N－P質控品，按使用量分裝，－20℃保存。

1.2 臨床標本 臨床標本為來源于本院的新鮮血清標本，按使用量分裝，－20℃保存。

1.3 方法

1.3.1 精密度分析 參照 CLSI EP5－A2文件［5］，選取高低兩種濃度臨床標本連續重復測定20次，計算批內精密度，以批內變異系數（CV批內）表示，最大允許CV為廠家標識CV批內的1／2。選取高低兩種濃度臨床標本連續測定20d，每天1次，計算批間精密度，以CV批間表示，最大允許CV批間為廠家標識CV批間的1／2。

1.3.2 加樣針攜帶污染率分析 將高濃度標本連續測量3次，測量值分別為H1、H2、H3；再將低濃度標本連續測量3次，測量值分別人為 L1、L2、L3。攜帶污染率（%）＝（L1－L3）／（H3－L3）×100%。

1.3.3 準確度分析 參照 CLSI EP15－A 文件［6］，對可溯源的質控品進行檢測，檢測結果與已知靶值進行比對，計算相對偏差。

1.3.4 線性范圍分析 參照 CLSI EP6－A 文件［7］，選取濃度達到給定的上、下限值標準的低值標本（L）和高值標本（H），按照5L＋0H、4L＋1H、3L＋2H、2L＋3H、1L＋4H、0L＋5H 的體積比例混合制備6個標本，每個標本重復測定3次后計算均值。將實測值與理論值進行比較。以實測值為Y，理論值為X，計算回歸方程：Y＝aX＋b，要求相關系數（r）＞0.975或r2＞0.95，斜率a范圍為0.97～1.03，截距b與最高濃度比較接近0。

1.3.5 參考區間分析 參照CLSI C28－A2文件［8］，選取20例體檢健康者（男、女各10例）臨床標本，檢測各指標水平后建立參考區間，要求男、女健康者中，最多各允許有1例檢測結果超出推薦的參考區間。

2 結 果

2.1 精密度 （1）批內精密度：批內精密度分析結果見表1。結果表明肝纖四項的CV批內均未超過5%，也未超過廠家允許最大CV批內的1／2。（2）批間精密度：批間精密度分析結果見表2。結果表明肝纖四項的CV批間均未超過7.5%，也未超過廠家允許最大CV批間的1／2。

表1 肝纖四項檢測的批內精密度評價試驗結果

2.2 準確度 可溯源的肝纖四項質控品檢測及計算結果見表3。相對偏差均未超過±2%，優于廠家允許相對偏差（±10.00%）。

2.3 加樣針攜帶污染率 肝纖四項高濃度標本對低濃度標本造成的攜帶污染率都小于廠家允許的最大攜帶污染率（1.00‰），見表4。

2.4 線性范圍 肝纖四項線性范圍評價試驗結果見表5，對應的線性散點圖見圖1～4?；貧w方程各參數（r2、a、b）如圖所示，都未超過1.3.4中要求的水平。計算獲得肝纖四項的線性范圍如下：HA 為12.84～1 897.76ng／mL，LN 為20.98～960.59ng／mL，PⅢP N－P為10.72～1 923.48ng／mL，C－Ⅳ為11.85～1 964.49ng／mL。

表2 肝纖四項檢測的批間精密度評價試驗結果

表3 肝纖四項檢測的準確度評價試驗結果

表4 肝纖四項檢測的加樣針攜帶污染率評價試驗結果

表5 肝纖四項檢測的線性范圍評價試驗結果（ng／mL）

續表5 肝纖四項檢測的線性范圍評價試驗結果（ng／mL）

圖1 HA線性散點圖

圖2 LN線性散點圖

圖3 PⅢP N－P線性散點圖

2.5 參考區間 廠家提供的肝纖四項參考區間如下：HA＜100ng／mL，LN＜50ng／mL，PⅢP N－P＜30ng／mL，C－Ⅳ＜30 ng／mL。本研究納入的男、女性各10例體檢健康者血清標本檢測結果均未出現1例或1例以上超過上述參考區間的現象，故可以直接使用廠家提供的參考區間。

圖4 C－Ⅳ線性散點圖

3 討 論

醫學實驗室將某種檢測方法應用臨床實際工作之前，必須掌握檢測方法的性能指標。一般情況下，儀器或試劑生產已能夠提供常用性能指標的評價結果。但是在正式檢測臨床標本、發出檢測報告前，醫學實驗室仍需對廠商提供的主要方法學性能評價結果予以驗證和確認［9］。因此，醫學實驗室必須結合實際，合理選擇方法學驗證試驗、系統設計方法學驗證方案［10］。

檢測系統具有良好的重復性和無攜帶污染是方法學評價的前提和基本保障。本研究中，肝纖四項高低濃度標本檢測結果的CV批內和CV批間均小于廠家允許最大變異系數的1／2。因此，可以認為本研究中使用的化學發光免疫分析儀檢測肝纖四項的精密度是符合要求的。此外，本研究中的加樣針攜帶污染率分析結果也表明該分析儀的加樣針攜帶污染對標本檢測結果的影響是可以忽略的。

準確度可以采用與已有檢測系統比較、與室間質評結果比較、與質控品或外部標準品“靶值”比較、與參比實驗室比較、計算配制溶液標本的回收率等5種形式來評估。由于肝纖四項無國際標準品，故本研究選擇可溯源的質控品進行檢測，相對偏差計算結果顯示，各項指標的相對偏差均在可接受范圍內，說明該分析儀檢測肝纖四項的準確性是符合要求的。

可報告范圍應和線性范圍一致或在線性范圍內。本研究結果顯示該分析儀檢測肝纖四項的線性范圍是符合要求的。臨床標本檢測結果若超過線性范圍時，需對其進行進一步驗證后方可發出報告。超過下限時，檢測結果對目前的診療缺乏指導意義。超過上限時，則應在稀釋標本后進行在此檢測，但可稀釋的水平尚需驗證。

醫學實驗室如果采用廠家提供的參考區間，則必須驗證該參考區間是否適用于實驗室所服務的人群。本研究隨機選擇了20例體檢健康者的標本進行驗證，95%以上的檢測結果均在廠家提供的參考區間內，因此，可以認為廠家提供的參考區間基本適用于本實驗室。

本研究結果顯示，MAGLUMI 2000Plus型全自動化學發光免疫分析儀檢測肝纖四項的精密度、加樣針攜帶污染率、準確度、線性范圍均符合預期要求，廠家提供的參考區間可以接受，可用于臨床標本的肝纖四項檢測。

［1］Chang TT，Liaw YF，Wu SS，et al.Long－term entecavir therapy results in the reversal of fibrosis／cirrhosis and continued histological improvement in patients with chronic hepatitis B［J］.Hepatology，2010，52（3）：886－893.

［2］中華肝臟病學會肝纖維化組.肝纖維化診斷及療效評估共識［J］.中華肝臟病雜志，2010，10（5）：327－328.

［3］College of American Pathologists.Clinical Immunology Checklist［S］.IL，USA：College of American Pathologists，2006.

［4］中國合格評定國家認可委員會.ISO15189醫學實驗室質量和能力認可準則［S］.北京：中國合格評定國家認可委員會，2008：1－36.

［5］Clinical and Laboratory Standard Institute.Evaluation of precision performance of quantitative measurement methods.EP5－A2，Approved guideline－second edition［S］.Wayne，PA，USA：CLSI，2004.

［6］Clinical and Laboratory Standard Institute.User demonstration of performance for precision and accuracy.EP15－A，Approved guideline［S］.Wayne，PA，USA：CLSI，2001.

［7］Clinical and Laboratory Standard Institute.Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures.EP6－A，Statistical approved guideline［S］.Wayne，PA，USA：CLSI，2003.

［8］Clinical and Laboratory Standard Institute.How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory.C28－A2，Approved guideline－second edition ［S］.Wayne，PA，USA：CLSI，2000.

［9］Centers for Medicare＆Medicaid Services.Clinical laboratory improvement amendments of 1988：final rule［Z］.Bal，USA：Centers for Medicare＆Medicaid Services，2003.

［10］畢波，呂元.定量檢測方法學性能驗證的系統設計［J］.中華檢驗醫學雜志，2007，30（2）：143－145.