手足口病患兒機體免疫功能臨床研究

徐 俊，薛 建，黃 輝，邵雪軍，朱 宏（蘇州大學附屬兒童醫院檢驗科，江蘇蘇州 215003）

手足口病（HFMD）是以發熱和手足、口腔等部位皮疹或皰疹性咽峽炎為主要特征的一種嬰幼兒急性傳染病，病原體包括柯薩奇病毒（Cox）A16型（CoxA16）、埃可病毒和腸道病毒71型（EV71）等，其中以CoxA16、EV71最常見。由于EV71引起的神經系統并發癥，如無菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓灰質炎樣麻痹等較其他腸道病毒多見，且具有較高的病死率和致殘率，因此日益受到重視［1］。目前，國內局部地區手足口病流行強度較大［2］。本研究對236例HFMD患兒免疫功能進行了分析，旨在探討免疫功能變化在HFMD發生、發展過程中的作用，及其與疾病嚴重程度的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年7月至2012年5月本院收治的HFMD患兒236例，均符合《手足口病診治指南（2010年版）》診斷標準［3］，且外周血EV71、CoxA16RNA檢測均為陽性。236例患兒中，EV71RNA陽性且無并發癥患兒99例（EV71組），男58例、女41例，平均年齡（2.00±1.06）歲；CoxA16 RNA陽性且無并發癥患兒110例（CoxA16組），男71例、女39例，平均年齡（2.17±1.33）歲；經腦脊液或心肌鈣蛋白檢測確診的合并腦膜腦炎或心肌炎患兒27例（重癥組），包括EV71 RNA陽性患兒19例、CoxA16RNA陽性患兒8例，男15例、女12例，平均年齡（1.83±1.26）歲。同期收治的疝氣患兒24例納入對照組，男18例、女6例，平均年齡（2.22±1.17）歲。4組患兒性別、年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑 LC480型熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）擴增儀（德國羅氏），Epics XL－MCL型流式細胞儀（美國Beckman Coulter），EV71、CoxA16RNA熒光探針試劑盒（廣州中山大學達安基因公司），熒光標記單克隆抗體（美國BD）。

1.3 方法

1.3.1 外周血EV71、CoxA16RNA檢測 患兒入院后24h內采集外周血2mL，乙二胺四乙酸抗凝，采用實時逆轉錄PCR技術檢測EV71、CoxA16RNA，操作步驟參照試劑盒說明書。

1.3.2 淋巴細胞亞群檢測 患兒入院后24h內采集外周血2 mL，肝素抗凝，取50μL混勻全血標本與相應的熒光標記單克隆抗體10μL充分混勻，室溫條件下避光孵育15min后加入250μL溶血素，振蕩混勻后37℃水浴15min，再加入250μL磷酸鹽緩沖液（PBS），振蕩混勻后37℃水浴15min，再加入1 mL PBS振蕩混勻后1 800r／min離心5min，棄上清液，用濾紙吸干管壁，加入250μL PBS，振蕩混勻后采用流式細胞儀進行檢測。

1.4 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析；計量資料以表示，進行正態性檢驗及方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析（one－way ANOVA）進行多組間比較，采用t檢驗進行兩組間比較；P＜0.05為比較差異有統計學意義。

2 結 果

各研 究 組 間 CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋、CD3－CD19＋、CD3－CD16＋CD56＋、CD19＋CD23＋和CD4＋CD25＋淋巴細胞亞群百分比比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。其中，EV71組、CoxA16組和重癥組CD3＋和CD3＋CD4＋淋巴細胞亞群百分比均低于對照組（P＜0.05），重癥組CD3＋淋巴細胞亞群百分比低于EV71組和CoxA16組（P＜0.05），但EV71組和CoxA16組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；重癥組CD3＋CD8＋淋巴細胞亞群百分比低于對照組（P＜0.05），EV71組、CoxA16組與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；EV71組、重癥組CD3－CD19＋淋巴細胞亞群百分比高于對照組（P＜0.05），CoxA16組與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；重癥組CD3－CD16＋CD56＋淋巴細胞亞群百分比高于EV71組、CoxA16組和對照組（P＜0.05），但后3組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；EV71組、Cox－A16組和重癥組CD19＋CD23＋淋巴細胞亞群百分比均較對照組升高（P＜0.05），且EV71組較CoxA16組和重癥組升高更明顯（P＜0.05）。EV71組、CoxA16組和重癥組CD4＋CD25＋淋巴細胞亞群百分比均較對照組升高（P＜0.05）。

表1 各研究組患兒淋巴細胞亞群檢測結果（%，）

表1 各研究組患兒淋巴細胞亞群檢測結果（%，）

注：與對照組比較，＊P＜0.05；與重癥組比較，＃P＜0.05；與CoxA16組比較，ΔP＜0.05；－：表示無數據。

組別 n CD3＋ CD3＋CD4＋ CD3＋CD8＋ CD3－CD19＋ CD3－CD16＋CD56＋ CD19＋CD23＋ CD4＋CD25＋.18 13.50±5.98 5.00±2.11 4.77±0.79 EV71組 99 59.11±7.03＊＃ 30.22±6.53＊ 23.92±6.25＃ 26.25±7.27＊Δ 12.00±6.00＃ 14.16±5.61＊＃Δ 6.05±1.45＊CoxA16組 110 60.26±9.29＊＃ 32.82±6.29＊ 22.56±7.90＃ 22.83±6.31 13.00±6.10＃ 12.19±4.16＊ 6.05±1.60＊重癥組 27 54.43±8.03＊ 29.69±7.03＊ 19.96±3.68＊ 25.68±6.5＊ 16.93±5.66＊ 11.19±4.23＊ 5.61±1.39＊F－ 9.581 5.571 3.803 7.875 5.480 25.443 5.846 P對照組 24 66.42±6.62 36.09±5.92 25.52±4.08 20.30±5－ 0.000 0.001 0.011 0.000 0.001 0.000 0.001

3 討 論

HFMD是由腸道病毒感染導致的一類傳染性疾病，常見于嬰幼兒。腸道病毒屬的Cox A組16、4、5、7、9、10型，B組2、5型，?？刹《?3型和EV71等均能引起HFMD，最常見的是CoxA16和 EV71［4－5］。本院2011年7月至2012年月收治的HFMD患兒以CoxAl6和EV71感染居多，大部分患兒臨床表現為手、足斑丘疹或水皰疹及發熱、咽痛，病程1周左右，預后良好；少數出現頭痛、嘔吐、意識障礙、腦膜刺激征等臨床表現，極少數出現肢體弛緩性癱瘓、心動過速、氣急、發紺、昏迷和呼吸衰竭，屬于重癥患兒［6－7］。

本研究發現，EV71或CoxA16感染后，無論普通型還是重癥型HFMD患兒，免疫功能均發生明顯改變。病毒感染機體后，參與防御的主要是T淋巴細胞和自然殺傷（NK）細胞。在病毒入侵初期，作為機體固有免疫應答細胞的NK細胞首先產生應答，NK細胞活化后，產生干擾素γ（IFN－γ）、白細胞介素2（IL－2）、腫瘤壞死因子（TNF）等細胞因子，誘導輔助性T淋巴細胞（Th淋巴細胞）分化表達，從而發揮免疫調節作用［8－9］。本研究中，重癥HFMD患兒CD3－CD16＋CD56＋淋巴細胞亞群百分比較對照組、EV71組和CoxA16組明顯增高，表明重癥患兒機體內的NK細胞活化程度明顯上調。

CD3分子主要表達在T淋巴細胞表面，是T細胞成熟的表面標志。CD3＋T淋巴細胞又分為CD3＋CD4＋T細胞和CD3＋CD8＋T細胞兩類。CD3＋CD4＋T細胞主要為Th細胞，又可分為Th1和Th2型，前者參與機體對病毒和腫瘤的免疫反應，而后者參與對過敏性疾病和寄生蟲的免疫反應。CD3＋CD8＋T細胞又稱為細胞毒性T細胞，活化后可參與病毒的清除過程［10］。在 HFMD患兒中，CD3＋、CD3＋CD4＋T淋巴細胞亞群百分比較對照組明顯下降，且重癥患兒下降更顯著，表明HFMD患兒在對抗腸道病毒感染時，CD3＋、CD3＋CD4＋T細胞明顯受到抑制，且重癥患兒更為嚴重。重癥組患兒CD3＋CD8＋T淋巴細胞亞群百分比明顯下降，CoxA16組和EV71組均無明顯變化，提示重癥患兒對腸道病毒的清除能力明顯下降，CD3＋CD8＋T淋巴細胞亞群百分比的降低程度可能與疾病嚴重程度及預后有關。

CD4＋CD25＋T細胞則是一類調節性T細胞，能發揮抑制免疫調節的作用［11］。本研究中，HFMD患兒CD4＋CD25＋T淋巴細胞亞群百分比均上升，提示腸道病毒感染后，機體在CD4＋CD25＋T細胞的作用下，免疫調節作用受到了抑制。

本研究中，HFMD患兒體內具有體液免疫功能的B淋巴細胞CD3－CD19＋亞群及調節分化、黏附的CD19＋CD23＋淋巴細胞亞群百分比較對照組升高。這可能是細胞免疫功能抑制后，體液免疫功能的相對增高，也可能是機體在感染腸道病毒后，增強了相應的體液免疫能力。此外，EV71組升高較Cox－A16組更明顯，可能是由于EV71感染后抑制細胞免疫功能的能力更強或增強體液免疫功能的能力更強。

綜上所述，EV71和CoxA16感染所致HFMD患兒體內存在免疫功能的紊亂，重癥患兒免疫功能紊亂更為明顯，尤以CD3＋、CD3＋CD8＋和CD3－CD16＋CD56＋亞群的異常更為突出。在臨床診治過程中，應盡早對HFMD患兒進行CD3＋、CD3＋CD8＋和CD3－CD16＋CD56＋亞群監測，了解其動態變化，從而對患兒病情嚴重程度及預后作為正確判斷，同時應根據患兒免疫功能的具體狀態，給予適當的調節免疫功能的治療，從而提高治療效果。

［1］Brown BA，Oberste MS，Alexander JP，et al.Molecular epidemiology and evolution of enterovirus 71strains isolated from 1970to 1998［J］.J Virol，1997，73（12）：9969－9975.

［2］吳亦棟，尚世強，陳志敏，等.手足口病病原體流行特征分析及臨床意義［J］.中華兒科雜志，2010，48（7）：535－539.

［3］中華人民共和國衛生部.手足口病診療指南（2010年版）［Z］.北京：中華人民共和國衛生部，2010.

［4］McMinn PC.An overview of the evolution of enterovirus 71and its clinical and public health significance［J］.FEMS Microbiol Rev，2002，26（2）：91－107.

［5］Chan YF，AbuBaker S.Recombinant human enterovirus 71in hand，foot and mouth disease patients［J］.Emerg Infect Dis，2004，10（11）：1468－1470.

［6］Gau SS，Chang LY，Huang LM，et al.Attention－deficit／hyperactivity－related symptoms among children with en－terovirus71infection of the central nervous system［J］.Pediatrics，2008，122（2）：452－458.

［7］Verboon－Maciolek MA，Utrecht FG，Cowan F，et al.White matter damage in neonatal enterovirus meningoencephalitis［J］.Neurology，2006，66（8）：1267－1269.

［8］Cooper MA，Colonna M，Yokoyama WM.Hidden talents of natural killers：NK cell in innate and adaptive immunity［J］.EMBO Rep，2009，10（10）：1103－1110.

［9］Kohlmeier JE，Woodland DL.Immunity to respiratory viruses［J］.Annu Rev Immunol，2009，27（1）：61－82.

［10］金伯泉.醫學免疫學［M］.5版.北京：人民衛生出版社，2008：98－107.

［11］奚桂林.CD4＋CD25＋調節性T細胞研究進展［J］.國外醫學免疫學分冊，2004，3（2）：141－145.