葡萄抗病相關基因VvIPK2的克隆、序列分析及表達

王西成， 吳偉民， 趙密珍， 錢亞明， 王壯偉

(江蘇省農業科學院園藝研究所，江蘇 南京 210014)

葡萄作為世界第二大水果被廣泛種植和加工利用，為人類社會的發展創造了重要的經濟、生態和社會效益［1-5］，特別是美國科學雜志報道并證明葡萄果實及其加工產品中特異功能成分白藜蘆醇(Res)含量居各類水果之首［6-7］，進一步加速了世界葡萄產業的發展。葡萄霜霉病(Grapevine downy mildew)是由葡萄霜霉病菌［Plasmopara viticola(Berk.Et Curtis)Ber.et de Toni］引起的真菌性病害，易于多雨季節發生［8］，嚴重影響葡萄植株的生長及果實產量和品質的提高，給葡萄產業造成較大經濟損失［9］。到目前為止，葡萄霜霉病的防治仍以傳統的化學藥劑防治為主［10-11］，這不僅給食品安全帶來隱患，還大幅提高了生產成本，破壞了環境。隨著病原菌對殺菌劑抗性的產生，致使殺菌劑的效能大幅下降［12］，這使人們不得不將目標集中于更為安全的生物防治技術上來［13］。因此，深入研究葡萄抗霜霉病的作用機制具有重要的理論和現實意義。

近年來，有關葡萄霜霉病抗性方面的研究已取得了一定的進展。在生理生化方面研究發現，葡萄對于霜霉病菌抗性的強弱與其自身的組織結構和生理生化特性有著緊密的聯系，如:Allègre等［14］研究結果表明，葡萄植株對于霜霉病菌抗性的強弱與其自身葉片氣孔的數量、氣孔孔徑、葉片下表皮絨毛及蠟質層之間均存在密切聯系;當接種葡萄霜霉病菌后葡萄葉片中過氧化物酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和苯丙氨酸解氨酶的活性均明顯高于接種前［15-16］。此外，接種霜霉病菌后同樣能夠誘導葡萄葉片幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的提高，且這兩種酶活性的提高水平在不同的品種間存在一定的差異［15，17］。在分子方面研究發現，葡萄抗霜霉病性狀遺傳是主效基因控制的數量性狀遺傳，抗病主效基因主要存在于我國的野葡萄資源，而抗病微效基因則存在于歐洲葡萄，兩者可通過協同作用增強植株的抗病性［18-19］。

Ca2+是植物體內一種重要的信號轉導物質，植物可通過調節其濃度變化，積極參與植物體內的各種生理生化反應過程［20］。如:Ca2+作為應答病原菌侵染的重要信號轉導物質，可通過一系列信號轉導過程誘導防御相關基因的表達，進而提高植株自身的抗病性［21］。而由多磷酸肌醇激酶基因/三磷酸肌醇3激酶基因(IPK2/IP3K)所編碼的多磷酸肌醇激酶(IP3-kinase)可通過調節三磷酸肌醇(IP3)的水平促使液泡釋放Ca2+，引起胞質內Ca2+濃度的瞬間升高，進而起到信息傳遞的作用，參與植株體內多種生理生化過程的調控［22］。據此分析，IPK2/IP3K基因在提高植株抗病性過程中發揮著積極作用。目前，已從擬南芥［23］、鹽芥［24］等多種植物中克隆了多磷酸肌醇激酶基因，并且證明了該基因與植物應答非生物脅迫過程密切相關。在葡萄上，盡管已有關于VvIPK2基因部分序列信息的報道［25］，但其并未獲得該基因的全長cDNA序列，同時未對該基因的序列特征進行分析。有鑒于此，本研究以對霜霉病抗性較強的鮮食葡萄品種金星無核為試驗材料，首次獲得了VvIPK2基因全長cDNA序列，并對其結構特征及其在應答霜霉病菌脅迫過程中的表達模式進行了系統分析，以期為進一步開展葡萄VvIPK2基因功能研究，探討葡萄抗病的分子機制提供理論依據和基礎，同時也為今后利用基因工程技術培育抗病葡萄新品種提供可操作的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2012年9月在江蘇省農業科學院溧水植物科學基地內進行，供試葡萄品種為6年生金星無核。葡萄霜霉病病原菌(Plasmopara viticola)于江蘇省農業科學院院內葡萄資源圃病葉上分離獲得。

pMD19-T克隆載體、M-MLV逆轉錄酶、DNaseⅠ酶、Ex-Taq酶、dNTP、熒光染料 SYBR GreenⅠ均購自TaKaRa公司;T4 DNA連接酶購自Promega公司;DNA回收試劑盒、DL 2000 DNA Marker購自上海生物工程技術服務有限公司;DH5α感受態大腸桿菌(Escherichia coli)菌株由作者所在實驗室保存;各種引物均由上海英濰捷基貿易有限公司(http://www.invitrogen.com)合成，其編號及序列見表1。

1.2 病原菌制備及接種

從田間采回已受霜霉病菌侵染的病葉，先用自來水沖洗干凈，再經蒸餾水沖洗后置于20℃黑暗條件下保濕(相對濕度為95%)24 h，待新孢子囊長出后，用毛刷刷下孢子囊，無菌水配制成1 ml 8×104孢子囊霜霉病菌孢子懸浮液。接種前用載玻片萌芽法測定孢子囊的活性，萌發率高于85%為有效接種液。

挑選金星無核一年生幼嫩枝條噴施1 ml 8×104孢子囊葡萄霜霉病菌孢子懸液至淋濕狀態，然后套袋并放入濕棉球保濕，清水處理作對照。分別于接種后 0 h、4 h、12 h、24 h、48 h、72 h 采集經葡萄霜霉病菌侵染的葉片，液氮速凍后，置于-70℃冰箱中保存備用。

表1 引物序列、擴增片段大小及用途Table 1 Sequence of primers，size of amplified product and their applications

1.3 總RNA的提取及cDNA第一鏈合成

葡萄不同組織及霜霉病菌侵染后不同時期葡萄葉片總RNA的提取均參考北京華越洋生物科技有限公司生產的植物RNA提取試劑盒說明書進行。以總RNA為模板，利用引物P01反轉錄合成cDNA第一條鏈，引物P02延伸加帽子，空氣加熱條件下42℃保溫1 h，75℃保溫10 min，冰上冷卻2 min后，-70℃保存備用。

1.4 葡萄VvIPK2基因全長cDNA克隆

根據GenBank中已登錄的葡萄VvIPK2基因部分cDNA序列，參照王西成等［26］電子克隆方法克隆葡萄VvIPK2基因的全長cDNA序列。以cDNA為模板，利用引物 P03/P04進行 PCR擴增，獲得VvIPK2基因的完整ORF序列。反應體系(25μl)為引物 P03/P04(10 μmol/L)各 1 μl，Ex-Taq酶 (5 U/μl)0.25 μl，10 × PCR buffer(Mg2+plus)2.5 μl，dNTPMixture(10 mmol/L)2μl，上一步合成的cDNA 2μl，ddH2O補足至25μl。反應參數:94℃預變性5 min;94℃變性40 s，67℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35個循環;72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段用DNA凝膠回收試劑盒進行回收，最后將目標片段連接到pMD-19T simple載體上進行T/A克隆，DNA測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司(http://www.majorbio.com)完成。

以cDNA為模板，分別利用引物 P05/P06和P07/P08進行PCR擴增獲得VvIPK2基因的5'和3'非編碼區(UTR)序列。反應體系為25μl:Ex-Taq酶 (5 U/μl)0.25 μl，10 × PCR buffer(Mg2+plus)2.5 μl，dNTP mixture(10 mmol/L)2.0 μl，cDNA 2.0μl，引物 P03/P04或 P05/P06(10μmol/L)各1.0μl，ddH2O補足至25μl。反應參數:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，62℃退火40 s，72℃延伸50 s，共35個循環;72℃延伸10 min，4℃保存。目的片段的檢測、回收與測序均同上。

1.5 葡萄VvIPK2基因序列分析

利用DNAMAN 5.22軟件對 ORF、5'末端和3'末端3個序列進行拼接分析;核苷酸和氨基酸序列分別利用NCBI的BLASTn和BLASTp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行相似性分析;用DNAMAN 5.22軟件分析葡萄VvIPK2氨基酸序列與其他植物氨基酸序列的關系。

1.6 葡萄VvIPK2基因表達分析

分別提取金星無核葡萄不同組織及接種霜霉病菌后不同時期的葉片總RNA，經DNaseⅠ酶(RNase free)消化后分別取2μg，并以P01和P02引物進行反轉錄合成cDNA。利用Primer 3 Input(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)進行相關引物的設計，研究該基因在金星無核葡萄中的時空表達情況。以葡萄看家基因UBI(GenBank accession number:XM_002266714)作為內標基因進行qRT-PCR分析，目的基因相關引物序列見表1。qRT-PCR參照已有報道［26-27］，利用 Bio-Rad My-IQ2熒光定量 PCR 儀，對目的基因的時空表達特性進行實時熒光定量分析。反應體系按照SYBR Green I(TOYOBO)的說明書進行，反應條件為:95℃預變性10 s;95℃變性10 s，退火20 s，72℃延伸30 s，40個循環，同一樣品共設置3次重復，實驗數據采用 LinRegPCR［28］和 Excel軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 葡萄VvIPK2 cDNA全長的獲得及序列分析

首先以GenBank中已登錄的部分葡萄VvIPK2基因的cDNA序列(JQ429083)為種子序列在葡萄EST數據庫中進行BLAST檢索，將檢出的與種子序列同源性較高或有部分重疊的EST序列拼接組裝為重疊群(Contig)，再以此Contig為種子序列重復上述BLAST檢索過程，反復進行EST重疊群序列的拼接和比對，盡可能獲得葡萄VvIPK2基因的全長cDNA序列。

根據已獲得的葡萄VvIPK2基因cDNA全長拼接序列設計特異引物，進而以葡萄不同組織樣品的混合cDNA為模板進行PCR擴增，獲得VvIPK2基因的完整ORF序列(圖1A)。同樣根據電子克隆的序列設計特異引物 P05/P06，并利用特異PCR擴增，經克隆測序獲得該基因的5'末端(圖1B)。在所獲得的ORF內設計上游引物P07與下游引物P08擴增獲得VvIPK2基因的3'末端，包含3'UTR區和Poly A結構(圖1C)。

圖1 VvIPK2基因ORF(A)、5'末端(B)和3'末端(C)的擴增結果Fig.1 Am p lification of ORF(A)，5'end sequence(B)and 3'end sequence(C)of VvIPK2 gene

測序完成后對所獲得的VvIPK2基因的5'末端、ORF以及3'末端序列進行全長cDNA序列的拼接。拼接結果顯示該基因的全長cDNA序列為1 853 bp，其中包括918 bp的開放閱讀框(ORF)，615 bp的5'非編碼區，290 bp的3'非編碼區，以及30 bp的poly+(A)(圖2)。該基因已提交至NCBI，在Gen-Bank數據庫中的登錄號為:KF752483。該基因ORF區編碼一個含305個氨基酸的蛋白質，BioXM 2.6預測VvIPK2所編碼蛋白質的分子量為3.421×104，理論等電點(PI)為5.38。

2.2 葡萄VvIPK2基因推導的氨基酸序列同源性分析及系統進化樹構建

為進一步分析VvIPK2的進化地位，本研究從NCBI公共數據庫中下載了擬南芥、鹽芥、大豆和菜豆共4個物種的IPK2氨基酸序列，用DNAMAN5.22軟件進行序列比對和系統進化樹的構建。結果表明，5條蛋白質序列含264～304個氨基酸殘基，序列之間差異較大，說明該基因在進化上并不十分保守，而不同物種間氨基酸序列的差異會導致其在功能上有所不同(圖3)。

系統進化樹分析結果表明，葡萄VvIPK2氨基酸序列與其他物種之間遺傳距離均較遠，在全部比較的4個物種中，與擬南芥同源性最高，達65.23%;與鹽芥同源性次之，為63.56%;而與大豆和菜豆的同源性則分別為54.84%和52.18%(圖4)。

圖2 VvIPK2基因的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of VvIPK2

2.3 葡萄VvIPK2基因在不同組織及不同處理下的表達

為了解VvIPK2基因在葡萄不同組織，以及葡萄葉片在接種霜霉病菌后不同時期的表達情況，本研究以UBI作為內參基因，利用qRT-PCR技術對該基因的時空表達特征進行了分析。結果發現，該基因在葡萄根、莖、葉、花中均有表達，但表達水平存在一定差異。其中，在葉片中的相對表達水平最高，根中的相對表達水平最低(圖5)。

而在接種霜霉病菌后的72 h內，VvIPK2基因的相對表達水平均高于對照(處理0 h)，且呈現出先升高后降低的表達趨勢。尤其在處理后12 h時，該基因的相對表達水平得到顯著提高，約為對照樣品表達量的22.5倍，之后開始逐漸下降，并于處理72 h后降至接近正常水平(圖6)。該結果表明，霜霉病菌可有效誘導葡萄葉片中VvIPK2基因的上調表達。

3 討論

圖3 VvIPK2基因與其他植物IPK2基因推導氨基酸序列的多重比較Fig.3 Alignment of the amino acid sequence of VvIPK2 and IPK2 genes of other plants

圖4 葡萄VvIPK2基因編碼的氨基酸序列與其他物種的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of grapevine and other plants based on the amino acid sequence encoded by VvIPK2

圖5 VvIPK2基因在葡萄不同組織中的表達水平Fig.5 Expression of VvIPK2 gene in different tissues of grapevine

圖6 霜霉病菌侵染后VvIPK2基因在葉片的表達水平Fig.6 Expression of VvIPK2 gene in grapevine infected by Plasmopara vitieola

葡萄霜霉病遍及世界各個葡萄產區，是葡萄生產上重要的真菌性病害之一［17，29］。霜霉病菌主要危害葡萄葉片，在發病初期可通過侵染葉片形成不規則黃褐色斑塊，嚴重時會導致葉片干枯脫落，大幅降低植株的光合效率;而當進入發病后期時，還可進一步侵染葡萄嫩稍、葉柄、幼果等部位，直接導致減產30% ～50%，重者甚至減產 80%以上［15，30］。鑒于葡萄霜霉病給世界葡萄產業發展所帶來的嚴重影響，積極開展葡萄抗病新品種選育工作就顯得尤為重要。Keen等［31］認為植物的抗病性是植物為了抵抗病原物的侵染、擴展和危害而在形態結構和生理生化，以及時間和空間上的綜合表現，其實質是抗病相關基因表達的結果。而葡萄作為世界性重要果樹，積極研究其中蘊含的豐富基因，特別是抗病基因具有重要的科學意義和應用價值。

在葡萄抗霜霉病基因研究方面，Luo等［32］首先通過RAPD標記技術發現了與葡萄抗霜霉病主效基因緊密連鎖的RAPD標記OPO06-1500，并證明該抗病標記在中國野生種株系中均存在。Fischer等［18］通過SSR技術定位了一個抗霜霉病的微效基因VvMD27。Kortekamp等［33］則通過差異顯示技術對接種葡萄霜霉菌12 h的抗病河岸葡萄(Vitis riparia)Gloire de Montpellier和感病歐洲葡萄Riesling進行了研究，發現并分離到一個定位于10號連鎖群的VRP-1抗病基因。Di等［34］通過對歐洲葡萄染色體連鎖圖譜進行分析，發現了分布在7個連鎖群上的82個抗病基因相似序列(RGA)標記，其中部分標記可定位在染色體的控制抗病表型的區域。而王沛雅等［35］則以中國原產抗霜霉病葡萄野生種華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)白河-35-1為材料，利用SMARTTM技術成功構建了由葡萄霜霉菌(Plasmopara viticola)誘導的葡萄葉片cDNA文庫，進一步對文庫中所得已知功能的ESTs進行蛋白功能預測分析，結果發現了部分編碼抗病防御蛋白相關的基因。

鑒于多磷酸肌醇激酶基因在植物逆境脅迫過程中所發揮的重要作用［23-25，36］，本研究在已有的葡萄多磷酸肌醇激酶基因片段的基礎上，進一步利用電子克隆結合RACE技術成功地從金星無核葡萄中分離到一個葡萄VvIPK2基因的全長cDNA序列。序列分析結果表明，該基因與多種植物已知氨基酸序列的同源性為52.18% ～65.23%，說明該基因在進化上具有并不十分保守的特點。盡管該基因在葡萄各個組織中均有表達，但其在葉片和莖中的表達水平要稍高于根和花，這與霜霉病菌主要危害葡萄葉片，嚴重時還會侵染嫩梢的特性之間可能存在某種程度的關聯。病菌接種試驗結果表明，葡萄葉片在受霜霉病菌侵染后的72 h內，VvIPK2基因的表達水平始終高于對照葉片(處理0 h)，且在接種后12 h時該基因的相對表達水平達到最高值，為對照的22.5倍，遠高于高超等［25］所獲得的高于正常水平12倍的研究結果，說明VvIPK2基因積極參與了葡萄應答霜霉病的過程。

總之，本研究通過分離葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2的全長cDNA序列，并對其序列特征和時空表達特點進行了初步研究，發現該基因可能在葡萄應答霜霉病菌侵染過程中發揮著重要的作用，這為進一步通過基因工程手段驗證其功能，進而從分子水平上揭示葡萄對于霜霉病的抗性機理提供了重要的理論參考。

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