亞硒酸鈉對鼠胚胎干細胞及奶山羊-鼠異種重構胚發育率的影響

張寶修， 尹 多， 姜園園， 孫婧陶， 李鐘淑， 方南洙

(延邊大學農學院動物科學系，吉林 延吉 133000)

胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ESC)是未分化的具有全能性的干細胞，能夠在體外增殖［1-3］。由于胚胎干細胞與胚胎生長特性比較接近，胚胎干細胞早期在子宮內的代謝特點，因此以胚胎干細胞做為供核細胞有著很大優勢。但胚胎干細胞只有在含氧1%～5%條件下才能生長良好。在含氧量低的條件下，胚胎干細胞自發分化會受到阻礙，并且能維持多功能性［4］，由于體外培養含氧量較高，所以胚胎干細胞在體外培養條件要求較高。一些細胞在低氧條件下不能得到氧化磷酸化產生的ATP，必須依靠線粒體產生的ATP來滿足能量的需求［5］，而胚胎干細胞在含氧較低條件下仍能很好的增長并能保持細胞多功能性。但在含氧較低的子宮頸部分只有少量的不成熟的線粒體［6-7］，因此有些細胞ATP能量的供應會受到阻礙，克隆胚胎發育受阻，胚胎干細胞做為供核細胞有利于胚胎發育，并且也能夠起到保障大量基因遺傳。試驗結果表明，分化干細胞內染色體數量有所增加并且形態上也更為類似［7］，胚胎干細胞可以描述胚胎分化的一個階段并可提供一個檢測早期線粒體代謝動態變化的模型。細胞通過線粒體電子運輸系統產生大量的ATP，氧化磷酸化會產生氧化產物［8］。這些代謝產物可能含有活性氧，活性氧可能參與胚胎生長調節、基因表達調節等。但這些氧化產物過量積累，胚胎抗氧化保護機制不足，胚胎發育會受到阻礙。胚胎對氧化損傷很敏感［9］，胚胎對活性氧(Reactive oxygen species，ROS)擁有一個有效的抗氧化系統［10］。體外成熟或體外受精僅僅擁有自身抗氧化系統是不夠的，因此需要外源性抗氧化劑的加入。硒是內源性抗氧化劑，亞硒酸鈉(Sodium selenite，SS)是清除細胞內自由基的一種外源性抗氧化劑。觀察亞硒酸鈉在異種重構胚胎各個時期抗氧化性，有利于體外胚胎發育率的提高，為體細胞克隆胚胎抗氧化機制研究做基礎。

由于誘導異種重構胚獲得胚胎干細胞分化的細胞在實際應用上的排斥反應會大大減少等諸多原因，例如，來自異種胚胎干細胞分化的細胞用于皮膚移植排斥反應遠小于同種胚胎干細胞分化的細胞。誘導胚胎干細胞分化在近年來實際應用比較廣泛。但是胚胎干細胞分化的細胞在實際應用中危險性并未真正得到證實，是否會帶來后遺癥并沒有得到驗證。胚胎干細胞作為供核細胞抗氧化相關研究并不是很多，胚胎干細胞具有全能性，在抗氧化方面研究也就更有實際意義。

近些年來，由于稀有動物種類的不斷增加，因此在核移植科學方面上卵母細胞的供應也越來也越少。構思利用異種重組得到囊胚，獲得胚胎干細胞被誘導成能夠生育的卵母細胞的方法將會在今后人類不孕不育上做出突出貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗用小鼠為良種肉牛選育中心實驗室飼養。從中選取6～8周齡的雌性小白鼠50只以及10周以上的雄性小白鼠15只。

乙二胺四乙酸(EDTA)、谷氨酰胺、乳酸鈉、葡萄糖、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、礦物油、NaCl、KCl、KH2PO4、MgSO4、NaHCO3、CaCl2、酚紅、高糖 DMEM、絲裂霉素C、白細胞抑制因子(LIF)等均購自Sigma;胎牛血清購自四季青公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胎兒皮膚成纖維細胞的獲得及飼養層的制備 取妊娠13.5 d的小白鼠，用無菌方法解剖小鼠得到胚胎，將胚胎取下之后放在含有D-PBS的無菌培養皿中。去除胚胎頭部、四肢和內臟，用DPBS清洗3次或更多次。用無菌外科刀將其胚胎剪碎至1 mm3的小塊。移到無菌錐形瓶中，加入5 ml的0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA，在37℃的培養箱中消化30 min，加入10 ml的含有10%FBS的DMEM終止消化。將其過濾，濾液以1 000 r/min、7 min進行離心。棄上清液，向離心管中加入1 ml含有20%FBS的DMEM，重懸細胞后移入無菌培養瓶中。在37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中進行培養成纖維細胞。

待胎兒皮膚成纖維細胞純化后，用含有10%FBS、10μg/m l絲裂霉素C的無菌DMEM處理成纖維細胞，放在37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養2～3 h。再用 PBS清洗2次，用0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA消化2 min，收集細胞后低速離心(1 000 r/min、7min)，去上清液，加入新鮮的含有10%FBS的DMEM培養液重懸細胞。以密度為1 m l 2×105個接種到96孔板中，作為飼養層細胞待用。

1.2.2 囊胚中胚胎干細胞的分離 囊胚來自經過超排、交配后3.5 d的小白鼠。無菌腹部取下子宮(連接輸卵管)，用室溫下的M2培養液沖洗子宮，將單個胚胎置于含有飼養層的96培養板孔內，每孔加入300μl的胚胎干細胞培養基(含白細胞抑制因子)，置于培養箱中繼續培養。囊胚培養12 h之后，用拉成的細針從滋胚層將內細胞團挑出，用D-PBS清洗2次，將細胞團移到礦物油覆蓋的0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA中，在37℃下孵育3～4 min后移到含血清的培養基中并輕輕吹散，使其成為有3～5個細胞組成的小細胞團，不要分成單個細胞。將小滴內的所有內含物移到制備好的飼養層細胞培養板內。每天進行觀察，2 d后可以見到小的克隆細胞，即胚胎干細胞。

囊胚培養12 h后，用PBS清洗3次，分別用濃度10μg/ml的Hoechst33342和10μg/ml碘化丙啶在37℃染色15 min(注意避光)，染色結束后用PBS清洗2次，封片，在熒光顯微鏡下觀察其染色情況并照相。

1.2.3 胚胎干細胞過氧化氫氧化損傷最適濃度的篩選 使用外源性過氧化氫(H2O2)對胚胎干細胞進行氧化應激刺激并建立模型，測出不同濃度的H2O2對胚胎干細胞的氧化損傷狀況，以確定建立H2O2氧化損傷模型的最適濃度。用0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA對細胞消化3 min，PBS清洗3次(速度要快，防止分化)，以每孔1×102～5×102個胚胎干細胞接種到96孔板，每孔細胞匯合長至80%加入200μl胚胎干細胞培養基。分別配制0 μmol/L(對 照)、30 μmol/L、60 μmol/L、90 μmol/L、120 μmol/L、150 μmol/L濃度的 H2O2，加入到胚胎干細胞培養基中。培養4.5 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml用PBS配)20μl繼續孵育4 h，終止培養，小心吸出孔內上清液。每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分融解。使用酶標儀(選擇490 nm波長)，測出OD值。處理組的OD值與對照組的OD值的比值是增殖率。以細胞增殖率50% ～60%為建立H2O2氧化損傷模型的最適濃度。

1.2.4 亞硒酸鈉對小鼠胚胎干細胞氧化損傷的保護作用 將最適濃度的H2O2作用于細胞4.5 h后，再分別向干細胞培養基中加入0μmol/L(對照)、1.5 μmol/L、2.5 μmol/L、3.5 μmol/L、4.5 μmol/L和5.5μmol/L不同濃度亞硒酸鈉。用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測細胞增殖率。

1.2.5 不同來源供核細胞的重構胚發育率的比較 分別用小鼠胚胎干細胞和胎兒皮膚成纖維細胞作為供體細胞。超數排卵3只小白鼠后采用背部取輸卵管，去掉卵丘細胞后取出帶有第一極體的卵母細胞，放在細胞松弛素B的小滴中，采用擠壓法進行去核。將供體細胞分別用胰蛋白酶消化后，挑選細胞質生長均勻，質量好的細胞做為供核細胞。將供核細胞注入到卵母細胞的卵黃周隙中，以便融合。使用直流電脈沖融合后用濃度5μmol/L的離子霉素對重構胚進行預激活5 min，之后移入到2 mmol/L的二甲基氨基嘌呤激活4 h。激活之后放入平衡好的培養液小滴中進行培養，72 h進行半量換液，每隔24 h進行觀察記錄發育率。

1.2.6 亞硒酸鈉處理對過氧化氫氧化損傷下胚胎干細胞重構胚發育率的影響 用最適濃度的H2O2和亞硒酸鈉處理小鼠胚胎干細胞，培養14 d后細胞生長匯合至80%可做為供核細胞，生產重構胚，并比較其發育率。

1.2.7 奶山羊-鼠異種重構胚的構建 以延邊奶山羊胎兒皮膚成纖維細胞細胞做為供核細胞，來生產異種重構胚，并記錄發育率。重構胚獲取方法同方法1.2.5。

1.2.8 異種重構胚內部ROS含量的檢測 將胚胎從培養液中取出，用PBS清洗3次，置于濃度為10 μg/ml的DCFH-DA染色液小滴中，避光染色37℃15 min。PBS清洗2次。熒光顯微鏡下觀察其染色情況并照相。熒光圖片用Image-6.0軟件進行量化分析。

1.2.9 數據分析 采用SPSS 17.0軟件試驗結果進行統計分析。采用方差分析的方法檢驗數據的差異顯著性。

2 結果

2.1 胚胎干細胞的獲得

囊胚在培養12 h之后，分別用Hoechst 33342和PI在37℃染色可以清晰的看到內細胞團(圖1)，獲得內細胞團在飼養層上進行共培養，經過4 d的克隆培養得到大量的胚胎干細胞。

2.2 亞硒酸鈉對胚胎干細胞抗氧化損傷的影響

圖1 囊胚內的細胞團Fig.1 Inner cellmass of blastocyst

在胚胎干細胞培養基中分別加入0μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L、90 μmol/L、120 μmol/L和 150 μmol/L濃度的H2O2，以不添加H2O2對照組細胞增殖率為100%。結果顯示:30μmol/L、60μmol/L、90 μmol/L H2O2處理的細胞增殖率顯著高于 120 μmol/L、150 μmol/L H2O2處理(P＜0.05)(圖 2)。當H2O2濃度為90μmol/L時，胚胎干細胞增殖率降低至50% ～60%。因此，90μmol/L H2O2為最適合建立過氧化氫氧化損傷模型的濃度。

圖2 不同濃度的過氧化氫(H2O2)對胚胎干細胞的氧化損傷Fig.2 Oxidative damage of embryonic stem cell caused by different concentrations of hydrogen peroxide(H 2O 2)

90μmol/L H2O2處理胚胎干細胞4.5 h后，分別向培養基中加入 0μmol/L、1.5μmol/L、2.5 μmol/L、3.5 μmol/L、4.5 μmol/L和 5.5 μmol/L亞硒酸鈉，結果顯示，3.5μmol/L亞硒酸鈉處理的細胞增殖率顯著高于其他處理(P＜0.05)，且 1.5 μmol/L、2.5 μmol/L、4.5 μmol/L、5.5 μmol/L亞硒酸鈉處理間無顯著性差異(圖3)。表明亞硒酸鈉對90μmol/L H2O2氧化應激的最佳保護濃度則為3.5 μmol/L。

圖3 不同濃度的亞硒酸鈉對過氧化氫氧化損傷下胚胎干細胞的保護作用Fig.3 Protective effect of different concentrations of sodiumselenite on embryonic stem cells oxidated by H2 O2

2.3 亞硒酸鈉對不同來源供核細胞重構胚發育率的影響

采用生長良好的小鼠胚胎干細胞和皮膚成纖維細胞做為供核細胞，生產重構胚，統計其發育率(表1和圖4)。數據顯示，在培養2 d后胚胎干細胞重構胚的胚胎卵裂率顯著高于成纖維細胞重構胚的胚胎卵裂率(P＜0.05)，但兩組間的囊胚率差異不顯著。經亞硒酸鈉處理的胚胎干細胞重構胚卵裂率顯著高于未處理的卵裂率(P＜0.05)，兩組間的囊胚率差異也顯著(P＜0.05)。

表1 不同來源供核細胞重構胚的發育率Table 1 Developmental efficiency of embryonic stem cells of nuclei from different somatic cells

圖4 小鼠胚胎干細胞重構胚的產生過程Fig.4 The process of reconstructed embryos production from embryonic stem cells

2.4 亞硒酸鈉對延邊奶山羊-鼠異種重構胚發育率的影響

結果(表2)顯示，延邊奶山羊成纖維細胞構成的異種重構胚卵裂率和囊胚率顯著低于小鼠成纖維細胞構成的重構胚(P＜0.05)。添加亞硒酸鈉濃度為5 ng/ml［11］異種重構胚卵裂率顯著高于未添加亞硒酸鈉異種重構胚卵裂率(P＜0.05)，囊胚率差異不顯著。

表2 延邊奶山羊-鼠異種重構胚的發育率Table 2 Developmental rates of interspecies reconstructed embryo from Yanbian dairy goat and mouse

2.5 亞硒酸鈉對異種重構胚內部ROS含量的影響

對2-細胞、4-細胞、桑椹胚內部的ROS含量進行檢測，由表3可知，在2-細胞期，添加亞硒酸鈉的異種重構胚內部ROS含量顯著低于未添加亞硒酸鈉處理(P＜0.05);4-細胞和桑椹胚期，添加亞硒酸鈉的異種重構胚內部ROS含量與未添加亞硒酸鈉的差異均不顯著。

表3 胚胎內部的ROS含量Table 3 Reactive oxygen species(ROS)content inside embryos

3 討論

在體外，培養胚胎干細胞條件要求較高，分離培養的過程也比較復雜，影響環節諸多，要做到培養條件與體內環境盡量保持一致。把胚胎從透明帶中孵出是提取胚胎干細胞的關鍵，而輔助孵化技術有助于體外培養的胚胎從透明帶中孵化出。目前，輔助孵化技術有:機械法［12］、酶消化法［13-14］、酸化法和激光輔助孵化法［15］。機械法容易造成囊胚破裂，實施難度較大。酸化法對操作者的技術要求較高，并且對細胞的毒性較大。酶消化法簡單易行，但是對胚胎的損傷很大，并且消化后囊胚不容易貼壁。由于胚胎干細胞是來自于囊胚的內細胞團并且在移植前有一些代謝特點［16］。比如說，在體外培養的胚胎干細胞自動分化過程可以為檢測細胞從厭氧到需氧過度的動態性變化提供一個模型。細胞就能量供應來說氧化磷酸化要優于糖酵解［17］。細胞在體外成熟氧氣較多時，厭氧代謝途徑終止。正在分化或者已經分化了的細胞在有氧條件下用于氧化磷酸化的線粒體有所增加［18］。據之前報道，ROS水平過高，會使機體抗氧化損傷能力下降，從而導致細胞壞死。濃度過低，可致細胞凋亡［19-20］。在細胞里產生ROS的來源有多處，但大部分在線粒體［21］。因此，胚胎干細胞是檢測抗氧化性的一個良好平臺。本試驗首先用外源性H2O2對胚胎干細胞進行氧化損傷，之后采用亞硒酸鈉對胚胎干細胞的氧化損傷進行保護，測出細胞增殖率進行分析。結果顯示，當H2O2濃度為90.0μmol/L時，細胞增殖率較小，對胚胎干細胞氧化損傷較大，為適宜濃度。亞硒酸鈉對這種氧化應激的最佳保護濃度為3.5μmol/L。

異種重構胚技術，是通過使用分布比較普遍動物的卵母細胞對瀕臨滅絕動物進行重構胚，使稀有動物得到延續的一種方法之一。另外還可通過誘導異種重構胚干細胞分化成卵母細胞的方法。異種重構胚難點在于2個物種的遺傳距離和物種差異可能導致基因組轉錄和翻譯的失敗。優化異種重構胚的培養體系是提高重構胚發育率的方法之一，異種移植有著特定的重構胚體系，從而來適應供體核的移植，核重塑及重編程。供體核的選擇、融合激活策略的不同、培養體系的改變會對異種重構胚的發育也有著有很大的影響。供體核代數的不同有著特異的表達狀態［22］和 mRNA 表達模式［23］可能是重編程較差的原因。試驗結果表明，小鼠胚胎干細胞做為供核細胞得到的重構胚要顯著高于同種的體細胞移植［24］。有研究表明，用人類神經干細胞做為供核細胞與山羊卵母細胞獲得了異種重構胚［25］。細胞成熟促進因子是促使核膜破裂、染色體凝集，但是細胞成熟促進因子再激活后會迅速下降到常規水平。有專家采用卵母細胞預先激活［26］和延遲激活［27］的方法提高重構胚發育率。還有研究稱，采用不同培養液(mSOF和 TCM-199)處理喜馬拉雅斑羚-牛的異種重構胚培養，結果mSOF培養液能夠得到囊胚，而TCM-199沒有獲得囊胚［28］。本試驗中，亞硒酸鈉處理的小鼠胚胎干細胞重構胚和延邊奶山羊-鼠胎兒皮膚成纖維細胞異種重構胚的卵裂率顯著高于未經亞硒酸鈉處理的胚胎干細胞。

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