ETV1在胃腸道間質瘤中的特異性表達

季峰等

【摘要】 目的：探討ETV1在胃腸道間質瘤組織中的表達及臨床意義。方法：應用免疫組化、實時熒光定量PCR、Western-blot檢測ETV1在135例不同胃腸道間質瘤患者的腫瘤組織及瘤旁組織中的表達。結果：免疫組化結果顯示，ETV1在胃腸道間質瘤中陽性表達率為68.1%，顯著高于瘤旁正常組織的5.2%（P<0.05）。熒光定量PCR方法顯示，間質瘤組織中ETV1的相對表達Ct值（3.30±2.37）低于瘤旁正常組織的（6.19±2.86），腫瘤組織中ETV1的表達是正常組織的7.41倍，差異有統計學意義（P<0.001）。Western-blot法檢測顯示，ETV1蛋白在胃腸道間質瘤中的表達水平（1.24±0.67）也較瘤旁正常組織高（0.88±0.28）（P=0.0369）；Pearson相關分析顯示，ETV1mRNA和蛋白水平呈正相關（r=0.526，P=0.017）。結論：ETV1在胃腸道間質瘤中特異性高表達，可能與胃腸道間質瘤的發生發展有關，有望成為新的腫瘤標志物，為臨床治療提供新靶點。

【關鍵詞】 胃腸道間質瘤； 轉錄調控因子； 腫瘤發生

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of ETV1 in gastrointestinal stromal tumors and its clinical significance.Method：Surgical gastrointestinal stromal tumor tissues and adjacent normal mucosa were obtained from 135 patients with gastrointestinal stromal tumor.Immunohistochemistry was conducted to detect the distribution of ETV1 protein，while the quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction and Western blot method were used to detect the expressions of ETV1 mRNA and protein.Result：Immunohistochemical analysis showed the positive rate of ETV1 expression was 68.1% in gastrointestinal stromal tumor tissues，it was significantly higher than 5.2% in the adjacent normal samples（P<0.05）.Fluorescence quantitative polymerase chain reaction （PCR） showed that relative expression of Ct value was （3.30±2.37）in gastrointestinal stromal tumor tissues，it was significantly lower than （6.19±2.86） in adjacent normal samples，expression of ETV1 in tumor tissue was 7.41 times of normal tissue，the difference was statistically significant（P<0.001）.Western blot analysis revealed that the expression of ETV1 protein was （1.24±0.67） in gastrointestinal stromal tumor tissues，it was significantly higher than （0.88±0.28） in normal colorectal tissues （P=0.0369）.Pearson correlation analysis showed that the mRNA level was in positive correlation with the protein level（r=0.526，P=0.017）.Conclusion：The specific expression of the ETV1 is in a correlation with the pathogenesis of gastrointestinal stromal tumor.ETV1 is expected to be a new tumor marker and the new target for clinical therapy.

【Key words】 Gastrointestinal stromal tumor； Transcription regulatory factors； Tumorigenesis

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Zhejiang University Medical College，Hangzhou 310000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.25.001

ETS家族是最大的信號依賴轉錄調控因子家族之一，其過度表達和許多人類腫瘤發生有關，近年來已成為各國學者關注的重點。ETS變異體1（ETV1，ER81）是ETS家族成員之一。已有研究表明，ETV1在乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、尤文氏瘤中過度表達，參與腫瘤的形成和發展[1-5]。國外已有研究發現，ETV1在胃腸道間質瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）細胞中存在普遍高表達[6]，但是國內鮮有相關報道。本實驗采用免疫組織化學、實時熒光定量PCR和Western-blot方法檢測GIST及瘤旁正常組織中ETV1的表達，探索其表達差異的意義。endprint

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取本院2012年5月-2014年1月經手術治療的GIST患者135例。其中男68例，女67例，年齡24～83歲，平均（58.7±11.8）歲，中位年齡59歲。腫瘤發生部位包括胃104例，小腸24例，其他部位7例。所有手術病例均為初治，術前均未行放、化療或伊馬替尼等分子靶向治療。GIST標本取自病灶中央無壞死部分，另取距腫瘤邊緣大于3 cm的瘤旁正常組織，離體后立即切成大約0.5 cm小塊，于10 min內放于液氮中保存，后轉存于-80 ℃冰箱。部分標本用4%甲醛固定，石蠟包埋，做免疫組化染色。所有標本均經過病理科醫師證實為GIST。本實驗獲得醫院倫理委員會同意。

1.2 免疫組化染色 組織石蠟包埋制成厚約4 μm組織切片，常規HE染色和免疫組化染色。每批染色均用已知陽性切片做陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照。結果判定：以胞質、胞核或胞膜染有均勻棕黃色顆粒、染色強度高于背景非特異性染色者為陽性細胞。采用雙盲法，選取5個高倍視野進行計數。按半定量評分方法進行計算：根據每視野著色細胞占總細胞的數目（陽性細胞0、1%～25%、26%～50%、>50%）分別記為0、1、2、3分；按每張切片著色細胞的染色強度（陰性、弱、中、強）分別記為0、1、2、3分；根據兩項評分之和判斷結果：≤2分為陰性，≥3為陽性。

1.3 RT-PCR檢測ETV1 mRNA表達

1.3.1 總RNA提取 稱取100 mg組織，勻漿后用TRIzol法進行GIST組織及瘤旁組織的總RNA提取。紫外分光光度計定量并檢測其純度，A260/A280比值在1.8～2.0。按照Takara PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）試劑盒（Takara公司）說明書步驟將其逆轉錄為cDNA。

1.3.2 實時熒光定量PCR ETV1正向引物為

5-GCAGTCAAGAACAGCCCTTTA-3，反向引物為

5-TCAGGTTTCGGTGTATGAGTTG-3。以GAPDH為內參照，其正向引物為5-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3，反向引物為5-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3。取cDNA 1 μL，按照SYBR? Premix Ex Taq? （Tli RNaseH Plus）試劑盒（Takara公司）說明書步驟進行反應，95 ℃預變性30 s，隨后進行40個循環的PCR擴增反應（95 ℃變性5 s，60 ℃退火與延伸34 s）。腫瘤組織與正常組織的相對表達Ct值，即?Ct=Ct（ETV1）-Ct（GAPDH）。腫瘤組織中ETV1表達相對于瘤旁正常組織的倍數用2-??Ct計算。

1.4 Western blot法檢測ETV1蛋白表達 取100 mg新鮮組織，將組織粉碎后加入裂解液提取總蛋白，4 ℃離心10 min，提取上清液，BCA法測定蛋白含量。在提取出的蛋白中加入適量5×上樣緩沖液煮沸10 min。取等量樣本于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，電轉移至硝酸纖維素膜（NC膜）。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，與兔抗人ETV1單克隆抗體或GAPDH單克隆抗體4 ℃孵育過夜，洗膜，與辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔多克隆抗體室溫孵育1 h，洗膜。用ECL顯色曝光。組織中不同蛋白表達水平用目的條帶與內參GAPDH條帶的灰度值比值定量表示。

1.5 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗和單因素方差分析，計數資料用率表示，采用 字2檢驗，Kruskal—Wallis等級相關采用Spearman方法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ETV1的免疫組化染色結果 ETV1免疫組化陽性染色產物位于細胞核。ETV1在GIST中普遍高表達，陽性率達68.1%（92/135），但是在瘤旁正常組織基本不表達，為5.2%（7/135），差異具有統計學意義（P<0.05），見圖1。

3 討論

GIST是消化系統最常見的間葉源性腫瘤，它主要是由c-kit或者PDGFRA基因致瘤突變導致，發病率約為1/10萬～2/10萬人，近年來呈明顯增加的趨勢。伊馬替尼等分子靶向藥物的應用，極大地提高了GIST的藥物療效。但是，伊馬替尼的成功應用并未根除間質瘤，腫瘤復發和耐藥成為影響療效的關鍵因素[7-8]。因此，探索GIST表面分子特性，尋找新的分子靶標已成為目前GIST診治研究的熱點。

ETS家族是最大的信號依賴轉錄調控因子家族之一，現已發現30多個ETS家族成員，它們均含有一個由85個氨基酸組成的特異DNA結合區（ETS區），該區與靶基因啟動區一個富含嘌呤的序列GGAA/T結合后調節基因轉錄。ETV1是ETS家族成員之一，ETV1及其相關ETS轉錄因子可以調控多能祖細胞分化，在組織發育過程中差異表達，過度表達促進細胞惡性改變[9-10]。在一些腫瘤中ETV1基因參與某些染色體易位突變，基因融合產生嵌合體蛋白導致細胞惡性變，被認為是促使腫瘤發生的主要因素之一，如前列癌中ETV1和跨膜絲氨酸蛋白酶2基因的融合、尤文氏肉瘤中ETV-1和EWS基因的融合[1，5]。前列腺癌中過度表達的ETV1也可以和雄激素受體作用促成腫瘤的侵襲與轉移[11]。其他腫瘤如黑色素瘤、乳腺癌中也存在ETV1蛋白過度表達，在調控腫瘤細胞增殖中起重要作用[2-4]。進一步研究表明，ETV1對靶基因的作用由復雜的調控網絡進行調節。各種信號激活Ras/Raf/MAPK信號通路是調控ETV1的主要途徑[2，12-13]。Ras/Raf/MAPK通路的激活導致ETS轉錄因子活化，從而調控生長和周期相關基因，如c-myc、junB、cdc2和cyclinD139[14]。在ETS的參與作用下，Ras信號成功轉化成一系列生長、凋亡相關基因。在前列腺癌、黑色素瘤中，Ras-MAPK-ETV1通路進一步得到了驗證，Ras-MAPK的激活是調控ETV1的主要途徑[2，12-13]。Chi等[6]研究發現，ETV1在伊馬替尼敏感或耐藥GIST細胞中普遍表達，且ETV1在GIST中的表達水平明顯高于其他腫瘤，如胃癌、肝癌、結直腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、卵巢癌等。ETV1能夠與KIT協同作用，調控GIST細胞的增殖凋亡與惡性轉變。endprint

本研究結果表明，ETV1在GIST組織中的基因和蛋白表達水平均顯著上調，在瘤旁正常組織很少表達，與Chi等[6]研究結果符合。該結果提示ETV1在GIST中特異性表達，可能與腫瘤的發生發展具有相關性。但是否將ETV1的表達作為評估腫瘤惡性程度及預測發展仍有待進一步研究。深入探索ETV1在GIST發生發展中的可能作用機制，將為GIST的診治提供新的思路。

參考文獻

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（收稿日期：2014-03-27） （本文編輯：歐麗）endprint

本研究結果表明，ETV1在GIST組織中的基因和蛋白表達水平均顯著上調，在瘤旁正常組織很少表達，與Chi等[6]研究結果符合。該結果提示ETV1在GIST中特異性表達，可能與腫瘤的發生發展具有相關性。但是否將ETV1的表達作為評估腫瘤惡性程度及預測發展仍有待進一步研究。深入探索ETV1在GIST發生發展中的可能作用機制，將為GIST的診治提供新的思路。

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（收稿日期：2014-03-27） （本文編輯：歐麗）endprint

本研究結果表明，ETV1在GIST組織中的基因和蛋白表達水平均顯著上調，在瘤旁正常組織很少表達，與Chi等[6]研究結果符合。該結果提示ETV1在GIST中特異性表達，可能與腫瘤的發生發展具有相關性。但是否將ETV1的表達作為評估腫瘤惡性程度及預測發展仍有待進一步研究。深入探索ETV1在GIST發生發展中的可能作用機制，將為GIST的診治提供新的思路。

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（收稿日期：2014-03-27） （本文編輯：歐麗）endprint